WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

№ Название белка № в базе % Мол. масса, кДа/pI данных перекрытия эксперимен- расчетные NCBI тальные 1 2 3 4 5 1 Комплекс тяжелых и 47125326 40 450,0/5,07 26,2/6,легких цепей ферритина* 182516 41 16,4/5,2 2-коллаген 1 типа 32451581 18 165,0/5,35 129,3/9,3 Неизвестный белок 62702215 47 58,0/7,90 58,8/8,4 Винкулин, изоформа 24657579 18 120,0/5,30 116,7/5,VCL 5 Белок RRBP1 38014595 33 87,0/4,75 73,6/4,6 Белок теплового шока, 16507237 50 74,0/4,72 72,3/5,изоформа 5 (70 кДа) 1 2 3 4 5 7 Белок теплового шока 24234688 31 72,5/5,33 73,6/5,изоформа 9В (70 кДа) 8 30583257 55 56,0/6,60 59,7/9,-АТФ-синтаза митохондриальная 9 Коллаген-связывающий 1199487 32 45,5/8,35 46,5/8,белок, изоформа 10 15277503 54 40,0/4,75 40,2/5,-актин 11 Ассоциированный белок 4505021 33 40,0/8,70 41,4/8,1 рецептора липопротеинов низкой плотности 12 Продукт гена PIG14 33090237 37 39,5/ 8,72 46,4/8,13 Фосфоглицераткиназа 1 4505763 44 39,0/7,70 44,6/8,14 Аннексин А1 54696696 49 35,0/6,62 38,7/6,15 Глицеральдегид-3- 31645 70 35,5/8,40 36,0/8,фосфатдегидрогеназа 16 -тропомиозин, 15079982 33 33,0/4,6 33,0/4,изоформа 17 Аннексин 2, изоформа 2 62896643 57 32,7/6,50 38,6/7,18 Смесь изоформы 7 - 63252906 18 32,8/4,тропомиозина и 32,5/4,фибробластной 88928 25 32,8/4,изоформы тропомиозина 19 Маннозо-связывающий 16878112 21 32,5/6,40 40,2/6,лектин 20 Порин 31 HM 238427 60 30,5/6,75 30,6/8,21 -тропомиозин 45501027 28 30,0/4,62 28,5/4,22 -тропомиозин, 24119203 33 29,5/4,70 29,0/4, изоформа 23 Трансгелин 55637017 72 22,0/7,00 22,6/8,24 Циклофилин В, цепь А 1310882 70 19,5/9,80 19,6/9,(пептидилпролил изомераза В) 25 S100A10 49457320 38 11,0/6,82 11,2/6,29 ER-60 протеаза 1208427 65 57,0/6,12 56,7/5,(дисульфид изомераза) 30 Енолаза 1 4503571 68 47,0/6,57 47,2/7,31 Виментин 37852 69 56,0/5,30 53,7/5,35 Триозофосфатизомераза 4507645 31 26,0/6,40 26,7/6,* Данные белковые фракции, вероятно, представляют собой устойчивые олигомерные комплексы, возможно, стабилизированые поперечными ковалентными связями.

Участок Мол. масса, Да Аминокислотная последовательность Модиполипеп- пептида фикатидной ции* Эксперимен- Расчетная цепи тальная 6 - 13 805.43 804.42 VGVNGFGR 28 - 55 3324.60 3323.55 VDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGK M 28 - 55 3340.61 3339.55 VDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGK 2M 67 - 80 1613.86 1612.89 LVINGNPITIFQER 67 – 84 2041.08 2040.10 LVINGNPITIFQERDPSK 85 – 107 2534.18 2533.20 IKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEK M 87 – 107 2277.05 2276.03 WGDAGAEYVVESTGVFTTMEK 87 - 107 2293.05 2292.03 WGDAGAEYVVESTGVFTTMEK M 108 – 117 909.50 908.48 AGAHLQGGAK 118 - 139 2369.21 2368.20 RVIISAPSADAPMFVMGVNHEK 118 - 139 2385.22 2384.20 RVIISAPSADAPMFVMGVNHEK M 118 - 139 2401.21 2400.19 RVIISAPSADAPMFVMGVNHEK 2M 119 - 139 2213.13 2212.10 VIISAPSADAPMFVMGVNHEK 119 - 139 2229.12 2228.10 VIISAPSADAPMFVMGVNHEK M 119 - 139 2245.11 2244.09 VIISAPSADAPMFVMGVNHEK 2M 119 - 145 2949.43 2948.44 VIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLK M 119 - 145 2965.43 2964.44 VIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLK 2M 146 - 162 1861.98 1860.94 IISNASCTTNCLAPLAK 2C 163 - 186 2595.34 2594.35 VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK 163 - 186 2611.36 2610.35 VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK M 201 - 215 1411.81 1410.78 GALQNIIPASTGAAK 220 - 227 870.51 869.49 VIPELDGK 220 - 234 1662.90 1661.88 VIPELDGKLTGMAFR M 228 - 234 811.41 810.41 LTGMAFR M 235 - 248 1544.84 1543.80 VPTANVSVVDLTCR C 235 - 254 2211.10 2210.21 VPTANVSVVDLTCRLEKPAK C 264 - 271 829.43 828.43 QASEGPLK 310 - 323 1763.80 1762.80 LISWYDNEFGYSNR 324 - 335 1330.71 1329.64 VVDLMAHMASKE 324 - 335 1346.66 1345.64 VVDLMAHMASKE M 324 - 335 1362.68 1361.63 VVDLMAHMASKE 2M *M – окисление остатка метионина, C – пропионилирование остатка цистеина.

1 MGKVKVGVNG FGRIGRLVTR AAFNSGKVDI VAINDPFIDL NYMVYMFQYD 51 STHGKFHGTV KAENGKLVIN GNPITIFQER DPSKIKWGDA GAEYVVESTG 101 VFTTMEKAGA HLQGGAKRVI ISAPSADAPM FVMGVNHEKY DNSLKIISNA 151 SCTTNCLAPL AKVIHDNFGI VEGLMTTVHA ITATQKTVDG PSGKLWRDGR 201 GALQNIIPAS TGAAKAVGKV IPELDGKLTG MAFRVPTANV SVVDLTCRLE 251 KPAKYDDIKK VVKQASEGPL KGILGYTEHQ VVSSDFNSDT HSSTFDAGAG 301 IALNDHFVKL ISWYDNEFGY SNRVVDLMAH MASKE Рисунок 3. Результаты масс-спектрометрической идентификации глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы. Сверху – список триптических пептидов, обнаруженных при массспектрометрии. Снизу – перекрытие аминокислотной последовательности ГФДГ и обнаруженных пептидов. Последовательности пептидов выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

К ним относились глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (ГФДГ), винкулин, митохондриальная АТФ-синтетаза, фосфоглицераткиназа, а также ряд изоформ тропомиозинов, аннексинов и белков теплового шока.

Результаты идентификации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы представлены на рис. 3.

Сравнительный протеомный анализ белков в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах позволил выявить и идентифицировать белков, количество которых значительно уменьшалось в процессе дифференцировки, и 2 белка, отсутствовавших в пролиферирующих, но обнаруженных в дифференцирующихся миобластах. Результаты их идентификации представлены в табл. 2.

Таблица 2. Идентифицированные белки, количество которых изменяется в ходе дифференцировки миобластов.

№ Наименование белка № в базе % Мол. масса, кДа/pI (синонимы) данных перекрытия эксперимен- расчетные NCBI тальные 26 42476296 34 32,8/4,66 32,8/4,-тропомиозин изоформа 27 Аннексин V 999937 70 31,0/4,75 35,7/4,(липокортин V) 28 Белок S100А11 5032057 44 11,0/6,1 11,7/6,(кальгиззарин) 32 Неизвестный белок 16552261 27 38,0/4,90 47,5/5,33 Кальдесмон 1 33878450 21 37,0/5,25 36,7/5,34 Нуклеофоcмин 1, 40353736 40 33,5/4,90 29,5/4,изоформа 36 Cупероксиддисмутаза 38503339 57 22,0/6,9 22,2/6,37 Нейрополипептид h3 913159 40 22,0/7,40 21,0/7, (фосфатитидил этаноламин связывающий белок) 38 Пептидил пролил 51895760 35 17,0/6,90 18,0/7,изомераза А (циклофилин А) 39 Кофилин 1, 15012201 63 16,0/7,80 18,5/8,немышечный 40 Профилин 1 15488591 46 14,5/7,50 15,0/8,41 Галектин 1, цепь А 42542977 29 14,0/4,92 14,6/5,42 Неизвестный белок 62702215 38 59,0/8,30 58,8/8, Особый интерес представила динамика изменений белка S100A11 и немышечной формы кофилина. Белок S100A11 участвует в проведении тормозящего пролиферацию сигнала от рецептора к трансформирующему фактору роста-бета (ТФРБ) [Sakaguchi et al., 2004; Sonegawa et al., 2007].

Вероятно, относительно высокое содержание этого белка во вступающих в дифференцировку клетках может отражать их высокую чувствительность к сигналу от ТФРБ, благодаря чему обеспечивается достаточно быстрый выход миобластов из клеточного цикла, в то время как в неделящихся дифференцированных клетках необходимость в этом белке отсутствует (рис. 4).

Уменьшение количества немышечной формы кофилина закономерно отражает начало дифференцировки фибробластоподобных пролиферирующихся миобластов с немышечным типом подвижности в дифференцированные мышечные клетки.

Рисунок 4. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов человека на разных сроках индукции дифференцировки.

Стрелкой отмечена белковая фракция, идентифицированная как белок S100A11. Сверху указан срок инкубации клеток в дифференцировочной среде («День –2» – за два дня до начала индукции дифференцировки).

В дифференцирующихся миобластах отмечалось появление изоформы 1 тропомиозина (№26), присутствующей и в зрелой скелетной мышце. Другие тропомиозины, представленные в зрелой мышце (СМ1 - изоформа 3 и СМ2 – изоформа 1 -тропомиозина) в миобластах идентифицированы не были (рис. 5).

Фибробласты Пролиферирующие Дифференцирующиеся Зрелая миобласты миобласты (6 день мышечная ткань дифференцировки) 16 16 21 21 22 СМ1 СМРисунок 5. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков фибробластов, пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов и зрелой мышечной ткани. Номера идентифицированных белков соответствуют таблицам 1 и 2.

В целом, проведенный протеомный анализ позволил достоверно соотнести 39 из 42 идентифицированных белковых фракций с ранее описанными белками, зарегистрированными в базах данных NCBI и Swiss-Prot.

Идентификация новых белков в культивируемых миобластах человека.

Три из идентифицированных белков миобластов человека не были ранее зарегистрированы, хотя их существование предполагалось, поскольку ранее были обнаружены соответствующие им мРНК. Два из этих белков уменьшались в количестве в ходе дифференцировки миобластов. Один из них (№32 в таблице идентифицированных белков) был идентифицирован как неизвестный белок, сходный по структуре с виментином (gi: 16552261). Однако его экспериментальная молекулярная масса оказалась на 9,5 кДа меньше расчетной. Пептиды, полученные при трипсинолизе указанного белка, перекрывают участок от 93 до 403 а.о. (рис. 6), при этом расчетные молекулярная масса и изоэлектрическая точка фрагмента неизвестного белка без первых 92 а.о. оказались близкими к полученным экспериментально (37,4/4.81 и 38,0/4,90 соответственно). Это позволяет предположить, что обнаруженный белок является укороченным вариантом белка gi: 16552261.

Участок Мол. масса, Да Аминокислотная Модифиполипептид- последовательность кации* Эксперимен- Расчетная ной цепи пептида тальная 93 - 99 870.41 869.43 FANYIDK 102 - 108 906.52 905.46 FLEQQNK 109 - 118 1169.75 1168.71 ILLAELEQLK 125 - 134 1270.63 1269.55 LGDLYEEEMR M 176 - 186 1323.69 1322.61 EEAENTLQSFR 203 - 214 1405.78 1404.75 VESLQEEIAFLK 203 - 215 1533.91 1532.84 VESLQEEIAFLKK 262 - 271 1309.69 1308.60 NLQEAEEWYK 325 - 343 2203.08 2201.95 EMEENFAVEAANYQDTIGR M 370 - 380 1311.70 1310.65 MALDIEIATYR M 390 - 403 1570.95 1569.89 ISLPLPNFSSLNLR *M – окисление одного остатка метионина.

1 MSTRSVSSSS YRRMFGGPGT ASRPSSSRSY VTTSTRTYSL YASSPGGVYA 51 TRSSAVRLLQ DSVDFSLADA INTEFKNTRT NEKVELQELN DRFANYIDKV 101 RFLEQQNKIL LAELEQLKGQ GKSRLGDLYE EEMRELRRQV DQLTNDKARV 151 EVERDNLAED IMRLREKLQE EMLQREEAEN TLQSFRQDVD NASLARLDLE 201 RKVESLQEEI AFLKKLHEEE IQELQAQIQE QHVQIDVDVS KPDLTAALRD 251 VRQQYESVAA KNLQEAEEWY KSKFADLSEA ANRNNDALRQ AKQESTEYRR 301 QVQSLTCEVD ALKGTNESLE RQMREMEENF AVEAANYQDT IGRLQDEIQN 351 MKEEMARHLR EYQDLLNVKM ALDIEIATYR KLLEGEESRI SLPLPNFSSL 401 NLRGKHFISL Рисунок 6. Результаты масс-спектрометрической идентификации неизвестного белка с Мм/pI 38,0/4,90. Выявленные пептиды перекрывают фрагмент белка между 93 и 403 а.о.

Другие два белка (№ 3 и 42) были идентифицированы как соответствующие гипотетическому белку gi: 62702215. Молекулярная масса обнаруженных белков соответствовала указанному белковому продукту, однако изоэлектрическая точка отличалась в меньшую сторону.

Пролиферирующие миобласты Дифференцирующиеся миобласты Рисунок 7. Динамика неизвестных белков с Мм/pI 58,0/7,90 (обозначен белой стрелкой) и 59,0/8,30 (обозначен черной стрелкой) в ходе миогенной дифференцировки.

Интересно, что белок с большей pI исчезал в ходе дифференцировки, в то время как количество другого белка оставалось постоянным (рис. 7). Таким образом, эти белки, будучи продуктами одного гена, различно представлены в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах, возможно, в силу их разных функциональных особенностей.

Сопоставление данных протеомного анализа белков культивируемых мышечных клеток человека с информацией о конфликтных определениях аминокислотной последовательности белков, содержащейся в базе данных Swiss-Prot.

В базах данных аминокислотных последовательностей белков встречаются ссылки на имеющиеся аминокислотные конфликты (single amino acid conflicts).

Аминокислотные конфликты определяют как альтернативное присутствие одной или другой аминокислоты в определенной позиции аминокислотной последовательности белка. В некоторых случаях наличие аминокислотного конфликта объясняется не описанным ранее полиморфизмом, связанным с одноаминокислотной заменой. Но в подавляющем большинстве случаев конфликтные определения аминокислотных последовательностей возникают при перерасчете данных секвенирования нуклеотидной последовательности соответствующих генов, полученных разными группами авторов. Результаты протеомного анализа позволяют подтверждать отдельные варианты аминокислотных последовательностей, имеющиеся в базах данных.

Таблица 3. Результаты уточнения конфликта аминокислотной последовательности в белке hsp70 (heat shock protein 70).

Белок Значения Аминокислотные последовательности Зарегистрированные M/z триптических пептидов, соответствующих «аминокислотные идентифи- найденным значениям M/z (позиции). конфликты».

цирован- Жирным шрифтом выделены Подчеркнуты а.о., ных обнаруженные «конфликтные» обнаруженные при пептидов аминокислотные остатки масс-спектрометрии HSP70 1964.99 KSQIFSTASDNQPTVTIK (447 – 464) 447 K / N В данной работе были подтверждены отдельные варианты аминокислотных последовательностей в 40 зафиксированных в базе данных Swiss-Prot конфликтных определениях аминокислотной последовательности идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека.

Полученные данные были суммированы в таблице, фрагмент которой представлен ниже (табл. 3).

Таким образом, использование масс-спектрометрии для идентификации белковых продуктов генной экспрессии позволяет получать информацию, подтверждающую один из вариантов зафиксированных в базах данных конфликтных определений аминокислотной последовательности.

Сравнительный протеомный анализ белков культивируемых миобластов человека и некоторых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения.

Рабдомиосаркома – злокачественная опухоль скелетной мышцы. Клетки рабдомиосаркомы могут рассматриваться как озлокачествленные сателлитные клетки скелетной мускулатуры, поскольку в них экспрессируется характерный для последних ген Pax7 [Tiffin et al., 2003]. Рак предстательной железы представляет собой злокачественную опухоль эпителиального происхождения.

В качестве модели для исследования молекулярных механизмов этого заболевания используются культивируемые клетки линии LNCaP.

Соответственно, изучение белкового состава этих клеток представляется необходимым для дальнейшего определения характеристик этого объекта, в том числе для изучения потенциальных белковых маркеров рака предстательной железы. В целом, была идентифицирована 31 белковая фракция в клетках рабдомиосаркомы и 35 фракций в клетках рака предстательной железы. В их число входили белки NM23B, DJ-1 шаперонин-10, не идентифицированные в нормальных миобластах человека (табл. 4). В настоящее время последние два белка рассматриваются как вовлеченные в развитие опухолевых процессов [Melle et al., 2006; Yuen et al., 2008], а белок NB23B относится к продуктам гена NMЕ, некоторые из которых также вовлечены в указанные процессы [Tschiedel et al., 2008].

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»