WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

МАКАРОВ Андрей Александрович ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЫШЕЧНЫХ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук Л.И.Ковалев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.И.Левицкий.

доктор биологических наук, профессор С.П.Сяткин.

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «28» мая 2009 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «27» апреля 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из актуальных направлений современной науки является изучение пролиферации и дифференцировки клеток, так как эти процессы определяют ход роста, развития и регенерации различных тканей и органов. Рост, регенерация и гипертрофия скелетной мускулатуры происходят в результате пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток [Goldring et al., 2002; Charge, Rudnicki, 2004; Dhawan, Rando, 2005]. Экспериментальное изучение молекулярных механизмов, вовлеченных в протекание указанных биологических процессов, является важной задачей современной биомедицинской науки, так как позволяет выработать новые подходы к диагностике, профилактике и лечению ряда распространенных и социально значимых заболеваний. Завершение в 2001 году проекта «Геном человека» позволило достигнуть качественно нового уровня исследования молекулярных механизмов функционирования клетки за счет сочетания традиционных биохимических методов с рядом подходов, разработанных в рамках геномных и постгеномных дисциплин [Anderson, Anderson, 1998; Арчаков, 2000; Говорун, Арчаков, 2002; Шишкин, 2002; Шишкин и др., 2004]. Так, сочетание традиционных электрофоретических и хроматографических методов фракционирования белков с их идентификацией методами масс-спектрометрии позволяет существенно расширить возможности изучения белкового состава различных биологических объектов [Tomlinson et al., 2001; Koomen et al., 2005;

Chen et al., 2006; Doran et al., 2007]. Использование нормальных и опухолевых культивируемых клеток человека в качестве экспериментальной модели для изучения процессов дифференцировки и злокачественного перерождения позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов указанных процессов в организме человека, не сталкиваясь с разнообразными трудностями (в том числе и этическими), неизбежно возникающими при постановке соответствующих экспериментов на животных или человеке.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение протеомными технологиями особенностей белкового состава миобластов человека, культивируемых в условиях, обеспечивающих пролиферацию и индуцирующих дифференцировку, а также выяснение возможного участия отдельных белков в этих процессах и при опухолевой трансформации на примере злокачественных клеток мышечного и эпителиального происхождения.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1. Провести сравнительный протеомный анализ белков пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов человека, направленный на выявление и идентификацию белков, изменяющихся в ходе дифференцировки.

2. Сопоставить результаты протеомного анализа идентифицированных белков миобластов человека с материалами баз данных NCBI и Swiss-Prot.

3. Изучить различия белкового состава пролиферирующих нормальных миобластов человека и некоторых культивируемых опухолевых клеток мышечного и эпителиального происхождения с целью идентификации потенциальных онкомаркеров.

4. Оптимизировать клеточную тест-систему, использующую в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, для определения эффектов биологически активных соединений, подавляющих пролиферацию клеток.

Научная новизна работы. Получены новые данные об особенностях белкового состава пролиферирующих и дифференцирующихся культивируемых миобластов человека. В культивируемых миобластах человека обнаружено 3 новых белка.

Для 40 аминокислотных конфликтов в 12 белках культивируемых мышечных клеток человека подтверждена достоверность определения одного из вариантов аминокислотной последовательности.

Научно-практическая значимость. Работа имеет фундаментальный характер и направлена на изучение особенностей белкового состава культивируемых клеток человека и механизмов их дифференцировки.

Использование культивируемых опухолевых клеток человека позволило уточнить специфичность некоторых потенциальных онкомаркеров. В частности, показано присутствие белка AGR2, рассматриваемого в качестве перспективного онкомаркера, в культивируемых клетках рака предстательной железы, но не в культивируемых клетках мышечного происхождения.

Оптимизация клеточной тест-системы (в частности, использование бессывороточного контроля) позволила использовать ее для тестирования ростовых факторов, не только стимулирующих, но и подавляющих пролиферацию культивируемых миобластов человека.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Протеомными технологиями изучен белковый состав культивируемых миобластов человека на разных этапах дифференцировки; при этом идентифицировано 42 белковых фракции (в том числе 13 фракций, количество которых меняется в ходе дифференцировки) и три новых белка.

2. Подтверждено существование по одному из вариантов для 40 расчетных «конфликтных» определений в аминокислотных последовательностях идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека.

3. Проведенный сравнительный протеомный анализ белков нормальных миобластов человека и некоторых опухолевых культивируемых клеток мышечного и эпителиального происхождения позволил выявить ряд белков, потенциально вовлеченных в процессы опухолевой трансформации.

4. Оптимизирована клеточная тест-система, что позволило использовать ее для тестирования как стимулирующих, так и подавляющих пролиферацию рекомбинантных белковых факторов роста.

Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, симпозиумах и школах, в том числе на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (2006 г., Санкт-Петербург), Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (2007 г., г.Дубна), 2-м съезде Общества клеточной биологии (2007 г., Санкт-Петербург), 6-й Парнасовской конференции «Molecular Mechanism of Cellular Signaling» (2007 г., Польша, г.Краков), 32-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (2007 г., Австрия, г.Вена), Летней школе «Hottest Topics in Protein Research» (2008 г., Хорватия, г.Сплит), Европейском мышечном конгрессе (2008 г., Великобритания, г.Оксфорд), Европейском симпозиуме по кальцийсвязывающим белкам (2008 г., Бельгия, г.Левен), Школе молодых ученых «Методы культивирования клеток» (2008 г., Санкт-Петербург), Совещании «Muscle regeneration and Stem Cells: a multiorganismic approach» (2008 г., Польша, г.Неполомице) и др. Работа была отмечена присуждением стипендии им. члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича на 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ (из них 5 в зарубежной печати), включая 6 статей в профильных рецензируемых российских и международных журналах, 3 статьи в сборниках и 8 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка используемой литературы (200 наименований) и двух приложений. Работа содержит 9 таблиц и 26 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Использовались скелетномышечные миобласты человека (предоставлены к.б.н. Т.Б.Крохиной), фибробласты человека (предоставлены к.б.н. В.С.Ахуновым), клетки рака предстательной железы человека (предоставлены д.б.н. И.Г. Шемякиным), а также культивируемые клетки рабдомиосаркомы человека (приобретены в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН). Клетки культивировались в среде F-12 (миобласты), DMEM (фибробласты и клетки рабдомиосаркомы) или RPMI-1640 (клетки рака предстательной железы) производства фирмы «ПанЭко». Среды содержали Hepes, пируват натрия, гентамицин и 12,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия).

Микрофотографирование клеток проводилось при помощи микроскопа с цифровой фотонасадкой.

Дифференцировку миобластов индуцировали культивированием в дифференцировочной среде, содержащей 2% лошадиной сыворотки со сменой среды каждые 2 суток.

Для тестирования биологических эффектов различных веществ миобласты человека высевались на 96-луночные культуральные планшеты и инкубировались 2 суток в бесcывороточной среде. Затем в соответствующие лунки с клетками добавлялись растворы исследуемого препарата в культуральной среде с 3% эмбриональной телячьей сыворотки и инкубировались с ними в течение 3 суток, после чего проводилась фиксация клеток 10% раствором формалина и окраска 0,25% раствором красителя кристаллического фиолетового в 4% этаноле. Планшеты отмывались дистиллированной водой, связанный клетками краситель элюировался 50% этанолом. Поглощение света с длиной волны 595 нм, соответствующее пику поглощения генцианвиолета, измерялось с помощью планшетного спектрофотометра. Препараты рекомбинантных миостатина и механозависимого ростового фактора были предоставлены д.б.н.

А.Б.Шевелевым.

Приготовление образцов клеток, предназначенных для последующего электрофореза белков, проводилось следующим образом. Клетки механически снимали с поверхности матрасов, предварительно проинкубировав в среде без сыворотки в течение часа при температуре 4°С (с целью отмыть адсорбированные на поверхности клеток белки сыворотки, входящей в состав культуральной среды). Полученные препараты клеток до проведения протеомного анализа хранили при температуре -70 °С.

Фракционирование белков проводилось методом двумерного электрофореза по О’Фарреллу в модификации Ковалева [Kovalyov et al., 1995].

Образцы, содержащие 5-6 миллионов клеток, гомогенизировали 3-5 мин в мкл 9М раствора мочевины, содержащего 5% меркаптоэтанола, 2% тритона Х100, 2% амфолинов рH 3,5 – 10 (Sigma, США). Гомогенат осветляли центрифугированием, после чего образцы (по 100 мкл экстракта) фракционировали двумерным электрофорезом по О’Фарреллу.

Фракционирование в первом направлении представляло собой изоэлектрофокусирование в стеклянных трубках, заполненных 4% полиакриламидным гелем (ПААГ), приготовленном на 9М растворе мочевины, содержащем 2% тритона Х-100 и 2% смеси амфолинов с pН 5-7 и 3,5-10 в соотношении 4:1. Затем колонки ПААГ с разделенными в ходе изоэлектрофокусирования белками использовали в качестве стартовой зоны при фракционировании во втором направлении, которое проводили пластинах ПААГ с линейным градиентом концентрации акриламида 7,5-20% в присутствии 0,1% SDS.

Для визуализации белковых пятен гели окрашивались красителем Кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром. Денситометрию анализируемых фрагментов двумерных электрофореграмм проводили с использованием пакета программ Melanie 3 («GeneBio», Швейцария).

Идентификация белковых фракций методом MALDI-TOF массспектрометрии проводилась на базе Центра протеомных исследований при Институте биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН как описано ранее [Говорун и др., 2003]. Представляющие интерес белковые пятна вырезались из гелей и подвергались трипсинолизу. Масс-спектры триптических пептидов получали на масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия) с УФлазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-Да. Для идентификации белков полученные масс-спектры анализировали с помощью программы Mascot (Matrixscience, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование белкового состава культивируемых миобластов человека на разных сроках дифференцировки.

При культивировании в ростовой среде миобласты представляли собой фибробластоподобные одноядерные клетки и активно пролиферировали.

Достигшие монослоя клетки инкубировались в среде, индуцировавшей их дифференцировку, проявляющуюся в выходе клеток из клеточного цикла и слиянии части их с образованием многоядерных миотуб (рис. 1).

Рисунок 1. Культивируемые миобласты человека. Окраска - кристаллический фиолетовый.

Слева – одноядерные миобласты, справа – миобласты, дифференцирующиеся в многоядерные миотубы.

На типичных двумерных электрофореграммах белков миобластов человека при окраске азотнокислым серебром регистрировалось более 500 белковых фракций с молекулярной массой 8 – 200 кДа и изоэлектрической точкой 4,5 - 11,0 (рис. 2). Сорок две белковые фракции были идентифицированы с использованием методов времяпролетной и, в некоторых случаях, тандемной масс-спектрометрии. Сравнение двумерных электрофореграмм недифференцированных и дифференцирующихся миобластов показало, что представленность ряда белковых фракций зависит от срока инкубации в дифференцировочной среде, при том, что большинство белков сохраняли свое количественное соотношение во всех исследованных образцах. В соответствии со стратегией протеомных исследований [Шишкин и др., 2004] были идентифицированы 29 «постоянных» (количество которых не претерпевало существенных изменений при дифференцировке) белков (табл. 1).

Рисунок 2. Обзорная двумерная электрофореграмма белков пролиферирующих миобластов человека. Цифрами обозначены идентифицированные белковые фракции (номера соответствуют табл. 1 и 2).

Таблица 1. «Постоянные» белки, идентифицированные на двумерных электрофореграммах в недифференцированных и дифференцирующихся миобластах человека.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»