WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Лившиц Владимир Александрович СИСТЕМЫ КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ПОЛИ(3-ГИДРОКСИБУТИРАТА) 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант:

кандидат биологических наук Г.А. Бонарцева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.С. Капрельянц доктор химических наук, профессор Г.Е. Заиков

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 26 ноября 2009 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан _ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия проводятся интенсивные разработки и исследования полимерных систем для контролируемого высвобождения (ПСКВ) биологически активных соединений (БАС). Пролонгированная доставка БАС в организм в требуемых дозах позволяет устранить многие недостатки перорального, инъекционного, ингаляционного и других способов их введения при использовании традиционных лекарственных форм. Такими недостатками, чаще всего, являются повышенная токсичность и нестабильность БАС, неравномерная скорость их подачи, неэффективный расход действующего начала и др. Использование ПСКВ дает возможность планомерно и целенаправленно вводить в организм требуемую дозу препарата, что особенно важно при терапии хронических заболеваний. Более того, используя полимерную форму лекарственного препарата, можно варьировать время высвобождения от нескольких часов (наночастицы) до нескольких месяцев (матрицы и резервуары).

В настоящее время поли(3-гидроксибутират) (ПГБ) и его сополимеры, полученные биотехнологическим способом, привлекают большое внимание как биодеградируемые и биосовместимые полимеры для применения в различных областях и, в частности, в медицине. Являясь продуктом современной биотехнологии, ПГБ обладает широким спектром полезных эксплуатационных характеристик, среди которых, прежде всего, следует отметить биосовместимость и способность к биодеградации в организме с образованием нетоксичных конечных продуктов. В Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН разработана микробиологическая технология получения ПГБ разной молекулярной массы, в связи с этим в качестве полимерного носителя для исследования и разработки новых лекарственных форм был использован данный материал.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось создание пленочных систем и микросфер на основе ПГБ для контролируемого высвобождения различных лекарственных веществ (ЛВ), а также изучение высвобождения инкапсулированных веществ из полученных систем. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

получить полимерные пленочные системы и микросферы на основе ПГБ для инкапсулирования в них ЛВ;

1. усовершенствовать методы введения различных ЛВ в полимерную матрицу ПГБ применительно к разрабатываемым ПСКВ;

2. c целью разработки научных принципов создания нового поколения лекарственных форм пролонгированного действия изучить кинетику высвобождения ЛВ различной химической природы из полимерных пленочных систем и микросфер из ПГБ in vitro;

3. выяснить влияние таких определяющих характеристик системы, как ММ ПГБ, массовая доля ЛВ, размер и форма ПСКВ, на кинетику высвобождения ЛВ из полимерных систем на основе ПГБ in vitro;

4. провести комбинированные исследования как in vitro, так и in vivo высвобождения ЛВ из ПСКВ на основе ПГБ для оценки возможности их применения в качестве пролонгированной лекарственной формы.

Научная новизна. Впервые проведено моделирование системы высвобождения различных БАС из ПСКВ на основе ПГБ, представлены уравнения для описания этой системы. Впервые показано, что механизм этого процесса является двухстадийным – первый этап связан с преобладанием диффузионных процессов, когда скорость выхода БАС нелинейная и весьма высокая; второй этап – с доминированием деструкции полимерной матрицы, что соответствует кинетике высвобождения нулевого порядка.

Впервые проведены комплексные исследования влияния ряда значимых параметров на кинетику высвобождения БАС: молекулярной массы ПГБ, размера и формы ПСКВ, массовой доли БАС, а также химического строения инкапсулированного БАС.

Показана возможность использования ПГБ различной молекулярной массы для создания ПСКВ лекарственных препаратов широкого спектра действия.

Усовершенствованы способы введения различных ЛВ в полимерную матрицу ПГБ.

Разработан оптимальный способ получения микросфер заданного диаметра из ПГБ различной молекулярной массы с инкапсулированными лекарственными препаратами разного фармакологического действия.

Практическая ценность работы. Работы по созданию лекарственных форм на основе биоразлагаемых микросфер в России находятся на начальном этапе, и все имеющиеся на фармацевтическом рынке страны пролонгированные формы ЛВ экспортируют из других высокоразвитых стран. Полученные результаты могут быть использованы для создания новых отечественных лекарственных форм пролонгированного действия для лечения широкого спектра заболеваний.

Большинство работ в мире по созданию ПСКВ ведутся с использованием синтетических биоразлагаемых полимеров, в основном, таких как полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, имеющих ряд недостатков. Полученные в настоящей работе пленочные системы и микросферы из биосовместимого и биоразлагаемого бактериального ПГБ позволят разработать новые лекарственные формы, использование которых поможет избежать осложнений, связанных с воспалительной тканевой реакцией при применении ПСКВ на основе синтетических полимеров.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (279 источников). Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 9 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), третьей Санкт-Петербургской конференции «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007), 17-ом Европейском съезде по гипертонии (Милан, Италия, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, Украина, 2007), финале конкурса молодых ученых на 23-ей ежегодной научной конференции Американского Общества Гипертензии (Новый Орлеан, США, 2008), VI открытой украинской конференции молодых ученых по высокомолекулярным соединениям ВМС-2008 (Киев, Украина, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ (4 статей, 9 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение микробиологического ПГБ. В работе исследовали системы на основе поли(3-гидроксибутирата) в качестве матрицы-носителя лекарственных веществ разной фармакологии. В качестве продуцента ПГБ был использован штамм Azotobacter chroococcum 7Б. Клетки продуцента поли(3-гидроксибутирата) Azotobacter chroococcum 7Б выращивали при 28 °С в течение 48 часов на агаризованной среде Эшби. Затем для получения биомассы с высоким содержанием ПГБ штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б пересевали и выращивали на жидкой среде Берка.

Культивирование осуществляли в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 30 °С, рН 7.2 в течение 48 часов.

Выделение и очистка ПГБ из биомассы. Выделение из биомассы и очистка полимера включали следующие стадии: получение очищенной сухой биомассы (центрифугирование, промывка биомассы изопропанолом, сушка при 60 °С), получение раствора ПГБ (экстракция полимера из сухой биомассы хлороформом при умеренном нагревании (35-40 °С), фильтрация, упаривание раствора), получение очищенного ПГБ (осаждение ПГБ из раствора изопропанолом, фильтрация и промывка полученного геля изопропанолом, сушка при температуре 60 °С).

Определение молекулярной массы ПГБ. Молекулярную массу полимера определяли методом вискозиметрии. Измерения вязкости раствора ПГБ в хлороформе проводили при 30 °С. Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка - Хаувинка - Куна, используя следующие коэффициенты [] = 7,7·10-5·М0,82, где - вязкость, М – молекулярная масса ПГБ (Akita et al., 1975).

Лекарственные вещества, инкапсулируемые в полимерную матрицу ПГБ.

Использованные в работе химически чистые ЛВ фирмы "Aldrich-Sigma" (США) принадлежат трем фармакологическим группам: антибактериальные препараты – рифампицин, левофлоксацин и метронидазол, противовоспалительные препараты – индометацин и флурбипрофен, а также противоспаечный/ противотромботический препарат – дипиридамол.

Получение пленочных систем из ПГБ с инкапсулированными ЛВ.

В экспериментах по исследованию кинетических характеристик высвобождения ЛВ из матрицы ПГБ пленочных систем использовали 4 партии ПГБ с различной молекулярной массой (ММ): 320 кДа, 450 кДа, 1010 кДа, 1540 кДа. Использовали пленочные матрицы ПГБ толщиной 11, 22 и 39 мкм, которые содержали различные количества ЛВ (3.3, 10 и 30% мас.). Пленочные системы с заданным содержанием ЛВ получали путем растворения ПГБ и ЛВ в хлороформе с последующим испарением растворителя на стеклянной подложке при комнатной температуре.

Исследование контролируемого высвобождения ЛВ из пленочных систем in vitro. Исследование зависимости кинетических характеристик высвобождения ЛВ от молекулярной массы ПГБ полимерных пленочных систем проводили на пленках с дипиридамолом, от толщины полимерной матрицы – на пленках с дипиридамолом и индометацином. Исследование зависимости кинетических характеристик высвобождения ЛВ от природы самого ЛВ проводили на пленках толщиной 40 мкм, содержащих 10% мас. ЛВ. Скорость высвобождения лекарственных веществ регистрировали методом спектрофотометрии в области максимального поглощения водных растворов ЛВ. Высвобождение ЛВ проводили в 0.025М калий-фосфатном буферном растворе (рН = 7.4) при 37 °С в течение всего времени эксперимента (до суток). Каждые сутки инкубационную среду заменяли на новую. Суммарное высвобождение ЛВ из пленок ПГБ контролировали по разнице в концентрации ЛВ в пленках ПГБ до эксперимента и в конце его.

Исследование деградации пленочных систем из ПГБ in vitro. Степень потери массы пленочных систем в результате деструкции определяли гравиметрически после выдерживания пленок ПГБ толщиной 40 мкм с различной массовой долей дипиридамола (ДП) (1, 3.3, 10 и 30 % мас.) в калий-фосфатном буферном растворе (рН = 7.4) при 37 °С в течение 1, 3, 7, 15, 29 сут. с периодической сменой инкубационной среды. Одновременно регистрировали количество высвобождающегося ЛВ методом спектрофотометрии.

Получение микросфер из ПГБ с инкапсулированными ЛВ. Микросферы и наносферы с ЛВ получали с использованием метода одноэтапного эмульгирования.

Раствор ЛВ и ПГБ (ММ = 485 кДа) растворяли в хлороформе и постепенно добавляли к водному раствору поливинилового спирта (ПВС) различной концентрации (0.4-1.2 % мас.) при перемешивании с помощью механической верхнеприводной мешалки RZR 2021 (Heidolph, Германия) при 600-2000 об/мин или гомогенизатора SilentCruisher M (Heidolph, Германия) при 20 000 об/мин. После полного испарения органического растворителя однородные по размеру фракции микросфер получали фильтрованием через стеклянные фильтры с различным диаметром пор (16 и 40 мкм). Разделенные таким образом микросферы отделяли центрифугированием (6 мин при 4400 об/мин) с использованием центрифуги 5702 R (Eppendorf, Германия), а затем 3 раза промывали дистиллированной водой для полного удаления эмульгатора и ЛВ на поверхности сфер. Затем микросферы сушили в термостате при 60 °С. Процент включения ЛВ в микросферах определяли спектрофотометрически (по максимумам поглощения при и 415 нм) при сравнении с контрольным раствором ПГБ и ЛВ в хлороформе. Средний диаметр и стандартное отклонение у полученных партий микросфер определяли по микрофотографиям.

Исследование контролируемого высвобождения ЛВ из полимерных микросфер in vitro. Контролируемое выделение ЛВ из микросфер проводили при 37°С в 0.025М калий-фосфатном буфере (pH = 7.4) с небольшим добавлением эмульгатора (0.05% Triton X-10 по объему): 4 партии по 5 мг микросфер в 4 мл буфера перемешивали в бюксах при 50 об/мин на магнитной мешалке MS-01 (Elmi, Латвия).

При исследовании кинетики выделения ЛВ через заданные интервалы времени (1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18 часов, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 суток с начала эксперимента) микросферы отделяли от буфера центрифугированием при 14000 об/мин и добавляли 4 мл свежего буфера. Содержание ЛВ в опытном растворе определяли спектрофотометрически при сравнении с калий-фосфатным буфером. Остаточное содержание ЛВ в микросферах определяли, растворяя их в заданном количестве растворителя, с последующим определением концентрации ЛВ в растворе спектрофотометрически, сравнивая с контрольными растворами известной концентрации.

Исследование деградации микросфер из ПГБ in vitro. Деградацию микросфер с инкапсулированными ЛВ исследовали микроскопически на примере микросфер с дипиридамолом (10% мас.). Исследование деградации микросфер проводили в тех же экспериментальных условиях, что и исследование кинетики высвобождения ЛВ. В определенные промежутки времени (1-30 сут. с начала эксперимента) небольшую часть микросфер исследовали микроскопически и фотографировали.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»