WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Данные, полученные при измерении набухания, получили подтверждение и при регистрации мембранного потенциала. Добавление к слегка гипотонической среде 50 мМ KCl вызывало снижение мембранного потенциала, последующее добавление ATP способствовало восстановлению величины мембранного потенциала до исходного значения. Концентрация ATP, вызывающая полумаксимальный ресопрягающий эффект, составляла 13,2 мкМ, что хорошо согласуется с данными по ингибирующему действию ATP на набухание митохондрий в KCl-среде. Незначительные различия могут быть связаны с разными Набухание (540 нм) условиями инкубации. В присутствии Mg2+, деполяризация мембраны, индуцируемая добавлением 50 мМ KCl, не менялась, но ATP восстанавливал мембранный потенциал лишь частично. Магний в концентрации 2 мМ увеличивал концентрацию ATP (I50 = 174 мкМ), необходимую для полумаксимального ингибирования деполяризации мембраны, вызванной добавлением КСl. Атрактилозид, как и в случае измерения набухания митохондрий, частично ингибировал ресопрягающий эффект АТР.

КCl 50 мМ ATP 1 мМ КЦХФ 25 нМ 0.0.0.0.0.Мтх 0 100 200 300 400 500 Время, сек Рис. 9. Влияние KCl и ATP (1) на мембранный потенциал, генерируемый митохондриями Y. lipolytica.Среда инкубации: 0,5 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,3 – 7,4, 20 мМ Tris-сукцинат, 20 мкМ сафранин О, митохондриальный белок (Мтх) 0,мг/мл. (2) – в среду инкубации добавлен 2 мМ Mg2+; где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.

“Ресопрягающий” эффект АТР строго зависел от концентрации добавленного KCl: чем выше была концентрация добавленного к митохондриям KCl, тем более высокие концентрации ATP были необходимы для реполяризации мембраны. В присутствии физиологической концентрации KCl, равной 100 мМ, концентрация ATP, вызывающая полное ресопряжение, составляла 300 мкМ. Концентрации маннита и KCl были подобраны таким образом, чтобы вместе они составляли изоосмотический раствор.

Далее было исследовано влияние АТР на набухание митохондрий в KCl-среде в Мембранный потенциал (511-533 нм) зависимости от степени энергизации митохондрий. Для этого подобрали концентрации разобщителя КЦХФ, снижающие мембранный потенциал, но еще не вызывающие дополнительного набухания митохондрий. Было выяснено, что снижение мембранного потенциала под действием разобщителя даже на 10% от максимальной величины (измеренной в отсутствии разобщителя) требовало существенно более высоких, уже не физиологических концентраций ATP для ингибирования набухания митохондрий в KClсреде. Это означает, что ATP-зависимое ингибирование набухания митохондрий (т. е.

закрытие канала или поры) – это энергозависимый процесс.

Таким образом, нами впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен ATP-зависимый K+-канал, закрывемый добавлением ATP и названный нами по аналогии с ATP-зависимым K+-каналом митохондрий животных – YмитоКАТР.

Поскольку действие ATP на дрожжевые митохондрии было очень сходным с тем, что было описано для митохондрий животных (Миронова и др. 2004), нашим следующим шагом было систематическое исследование влияния на дрожжевые митохондрии веществ, известных как регуляторы митоКАТР.

Диазоксид, один из самых известных открывателей митоКАТР митохондрий животных, в низких (микромолярных) концентрациях не влиял на величину мембранного потенциала дрожжевых митохондрий, но при этом индуцировал высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в KCl-среде, дополненной 1 мМ ATP (С50 = 20 мкМ). GTP, GDP и UDP (в присутствии 5-HD), другие известные открыватели митоКАТР митохондрий животных, внесенные после добавления ATP, вызывали повторную деполяризацию мембраны и набухание митохондрий в KCl-среде, дополненной 1 мМ ATP. Кромакалим, активатор митоК+АТР митохондрий животных, в низких концентрациях (до 5 мкМ) индуцировал высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в КCl-среде, содержащей 1 мМ ATP, а в более высоких концентрациях амплитуда набухания уменьшалась. Добавление 5-HD (5-гидроксидекановой кислоты), ингибитора митоКАТР, приводило к уменьшению амплитуды спонтанного набухания дрожжевых митохондрий в KCl-среде. Максимальный эффект 5-HD достигался в концентрациях 50 мкМ и 5 мМ.

Таким образом, в митохондриях Y. lipolytica нами впервые обнаружен ATP-зависимый К+-канал, закрываемый, как и в митохондриях животных, при добавлении ATP.

Ингибирующий эффект ATP частично снимался Mg2+ неорганическим фосфатом. 5-HD также ингибировала активность канала. Диазоксид, кромакалим, UDP, GDP и GTP, а также подщелачивание среды и снижение мембранного потенциала активировали YмитоК+ATP канал в митохондриях Y. lipolytica. Поскольку использованные нами вещества, известные как регуляторы митоКАТР, действовали на митохондрии дрожжей Y. lipolytica так же, как и на митохондрии животных (открыватели митоКАТР открывали и YмитоК+ATP, а закрыватели митоКАТР закрывали и YмитоК+ATP) и примерно в тех же концентрациях, можно заключить, что нам впервые удалось обнаружить в дрожжевых митохондриях митоКАТР “животного типа”, ингибируемый ATP. Более того, на основании проведенного ингибиторного анализа можно утверждать, что митоКАТР дрожжей Y. lipolytica содержит не только компоненты, образующие К+-канал, но и сенсор ATP.

Поскольку принимается, что концентрация цитоплазматического ATP составляет примерно 1 мМ (большинство ATP-зависимых ферментов имеют величину Км для ATP, лежащую именно в этом диапазоне), это означает что в “нормальных условиях“ ATPзависимый К+-канал митохондрий Y. lipolytica, а возможно и других дрожжей аэробного типа обмена, ингибируемый микромолярными концентрациями ATP, должен находиться в закрытом состоянии. Однако, поскольку нами было найдено, что ингибирующий эффект ATP частично снимался Mg2+ и неорганическим фосфатом, можно предположить, что в физиологических условиях (при внутриклеточных концентрациях Mg2+ и Pн, равных примерно 5 – 10 мМ), ATP может реально выступать в качестве возможного модулятора ATP-зависимого K+-канала. Резкое снижение внутриклеточной концентрации ATP (ниже критического уровня) под действием разных неблагоприятных факторов может служить сигналом для открытия канала и, в конечном итоге, для запуска каскада реакций, ведущих к апоптозу. У факультативных анаэробов снижение внутриклеточного уровня ATP, напротив, будет способствовать закрытию канала, тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный – митохондриальный способ запасания энергии.

Выводы 1. Митохондрии Y. lipolytica лишены Са2+-фосфат-зависимой, циклоспорин Ачувствительной поры. В присутствие кальциевого ионофора Са2+ вызывал значительную деполяризацию мембраны, за счет, вероятно, активации Са2+/H+-обмена, без образования мегаканала.

2. В митохондриях дрожжей Y. lipolytica не индуцируется пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий.

3. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipolytica без образования мегаканала.

4. Впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен АТР-ингибируемый калиевый канал, функционально сходный с аналогичным каналом митохондрий животных: канал содержит не только канальную субъединицу, но и сенсор ATP. Предполагается участие обнаруженного нами канала в запуске апоптоза дрожжевых клеток.

Список публикаций Статья в рецензируемых журналах:

Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Zyl'kova M.V., Ural'skaya L.A., Popova K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. (2009) Induction of a non-specific permeability transition in mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts. J Bioenerg.

Biomembr. 41(3):239-249.

Тезисы докладов:

1. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Зылькова М.В., Романовская М.А. (2006) Окислительный стресс и индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica. Труды Всероссийской конференции молодых ученых “Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты”, Москва, 1-3 июня, стр. 173-174.

2. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Ural’skaya L.A., Guseva E.S. and Zvyagilskaya R.A.

(2006) Prooxidant-induced low-conductance channel in mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC, Moscow, 21-26 July Short Reports, suppl.

V. 14, p. 332.

3. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I. (2006). An mPTP-like pore in yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC, Moscow, 21-26 July Short Reports, suppl. V. 14, p. 336.

4. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Uralskaya L.A., Guseva E.S. (2006) Mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast does not undergo a typical permeability transition (mPTP). Prooxidans induced only a low-conductance channel for H+. 24th Small Meeting on Yeast Transport and Energetics. August 31- September 3, Program and Abstracts. p. 38А.

5. Kovaleva M.V. and Zvyagilskaya R.A. (2007) ATP opens a pore in Saccharomyces cerevisiae mitochondria, but closes in Yarrowia lipolytica mitochondria. The FEBS J., Abstracts of 33th FEBS Congress «Molecular Machines”, 7-12 July 2007, Vienna, Austria, 274 (1); p.124.

6. Zvyagilskaya R.A., Zyl’kova M.V., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A.

(2008) Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly regulated. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC Shoort Reports, S32.

7. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2009) Pathways for release of apoptotic factors from yeast mitochondria. The FEBS J. Abstracts of 34th FEBS Congress “life’s Molecular Interactions”, 4-9 July 2009, Prague, Czech Republic, P4-143, p. 8. M.V. Zylkova, E.I. Sukhanova, T.A. Trendeleva, M.V. Kovaleva, R.A. Zvyagilskaya.

(2008) More on permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria. Abstr. Bari Intern.

Symposium on “Mitochondrial physiology and pathology” IUBMB Sympos. S1. Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB, Athens (28 Jun – 3 Jul), SC2.38.

9. Зылькова М.В., Ковалева М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А., Звягильская Р.А. (2008) Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий. Труды 2-го Съезда микологов России с международным участием “Современная микология в России”, т.2, с. 127-128.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»