WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер рН 7,3 – 7,4, 20 мМ Trisпируват, 5 мМ Tris-малат, 20 мкМ сафранин О, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. Где указано, добавлены ЭГТА, неорганический фосфат (Рн) и КЦХФ.

Поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали специфический кальциевый ионофор ETH129, который, встраиваясь в мембраны, образует селективный Са2+ канал. Сам ионофор ETH129 не влиял на скорость поглощения кислорода дрожжевыми митохондриями, Мембранный потенциал (511-533 нм) величину мембранного потенциала и набухание органелл. При одновременном добавлении к митохондриям Y. lipolytica ионофора и умеренных концентраций Са2+ наблюдалось ускорение дыхания в «состоянии 4» до максимально возможного уровня, наблюдаемого в присутствии разобщителя КЦХФ и существенное снижение мембранного потенциала (Рис.

2), свидетельствовавшие о разобщение окисления и фосфорилирования, деполяризации мембраны и об индукции в этих условиях футильного Ca2+-цикла, вероятнее всего, в результате активации Са2+/H+-обмена.

Са2+ ETH ЭГТА КЦХФ 1 мМ 10 мкМ 1 мМ 25 нМ 0.0.Р N-Ац н 5 мM 2 мМ 0.0.0.Мтх -0.0 100 200 300 400 500 Время, сек Рис. 2. Влияние Са2+, ЕТН129 (ЕТН), N-ацетилцистеина (N-Aц), Рн и ЭГТА на генерацию мембранного потенциала митохондриями Y. lipolytica. Состав среды инкубации как на рис. 1. Где указано, добавлен КЦФХ.

Снижение мембранного потенциала, вызываемое одновременным добавлением к митохондриям Y. lipolytica Са2+ и ETH129, не было чувствительно к действию водорастворимого антиоксиданта N-ацетилцистеина (N-Ац) и частично восстанавливалось добавлением неорганического фосфата (Рис. 2), индуктора mPTP в митохондриях животных.

Са2+-ETH-зависимое снижение мембранного потенциала не было чувствительно и к действию циклоспорина А (ЦсА), ADP и Mg2+ – ингибиторам классической ЦсА-зависимой поры животных. Дрожжевые митохондрии не набухали в присутствии ETH129 и увеличивающихся концентраций Са2+ (Рис. 3). Отсутствие набухания не было связано со структурными Мембранный потенциал (511-533 нм) ограничениями, поскольку в присутствии антибиотика аламетицина наблюдалось высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий.

н Ca2+ Р 0.2 мМ Ca2+ 400 мкМ Ca2+ 300 мкМ ETH 300 мкМ 0.10 мкМ 0.Алам 0.2,6 мкг/мл 0.0.0 50 100 150 200 250 Время, сек Рис. 3. Влияние Ca2+, Рн, ETH129 (ETH) и аламецитина (Алам) на набухание митохондрий Y. lipolytica. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер рН 7,2 – 7,4, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, митохондриальный белок 0,5 мг/мл.

(1) – контроль, митохондрии в среде инкубации; (2) – где указано, добавлены ЕTH129, Ca2+ и Рн; (3)- аламетицин.

Совокупность полученных данных позволила сделать вывод, что митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены классической Ca2+-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры. Более того, неорганический фосфат, стимулирующий открытие Ca2+-зависимой поры в митохондриях животных, в дрожжевых митохондриях вызывал частичное восстановление мембранного потенциала.

Набухание (540 нм) В митохондриях дрожжей Y. lipolytica не индуцируется Са2+/пальмитат-зависимая пора Из литературных данных известно (Sultan, A., and Sokolove, P., 2001; Mironova, G.D., et. al., 2001), что низкие концентрации Сa2+ и насыщенных жирных кислот (пальмитата или стеарата) индуцировали в митохондриях животных открытие небелковой поры, характеризующейся нечувствительностью к циклоспорину А и неорганическому фосфату, отсутствием селективности для ионов дивалентных металлов, большей чувствительностью к Сa2+ по сравнению с классической Сa2+/Pн-зависимой порой, и способностью спонтанно закрываться. На дрожжевых митохондриях исследования такого рода не проводились, в том числе не было изучено влияние на них жирных кислот.

Мы нашли, что: 1) пальмитиновая кислота (а также стеариновая и пентадекановая) не может использоваться митохондриями Y. lipolytica в качестве субстрата окисления, скорость дыхания в присутствии 50 мкМ пальмитата практически не отличалась от скорости дыхания на эндогенном субстрате (Рис. 4, кривая 1). 2) Как и в митохондриях животных (Mironova, et al. 2001; Sultan and Sokolove, 2001), насыщенные жирные кислоты являются разобщителями - добавление их в низких (микромолярных) концентрациях к митохондриям, окисляющим пируват + малат или сукцинат, стимулировало дыхание в «состоянии 4» (Рис. 4, кривая 2) и снижало мембранный потенциал. Более того, атрактилозид, ингибитор транслоказы адениновых нуклеотидов, снимал (Рис. 4, кривая 3) и предотвращал стимуляцию дыхания, вызванную добавлением насыщенной жирной кислоты.

Следовательно, в митохондриях Y. lipolytica, как и в митохондриях животных, насыщенные жирные кислоты транспортируются через транслоказу адениновых нуклеотидов. Однако, в отличие от митохондрий животных, добавление Сa2+ к митохондриям дрожжей, обработанным насыщенными жирными кислотами, не вызывало дополнительных изменений в энергетических параметрах. Лишь в присутствии Сa2+ ионофора ETH129 имело место дополнительное снижение мембранного потенциала (Рис. 5), которое, как мы видели ранее, было вызвано, по всей вероятности, активацией Са2+/Н+-обмена, зависимое от эндогенных жирных кислот, поскольку полностью снималось добавлением БСА (Рис. 5).

ЭГТА, хелатор Сa2+, снимал дополнительное снижение мембранного потенциала, вызванное Сa2+ и ETH129. Инкубация митохондрий с Са2+ и пальмитиновой кислотой не вызывала высокоамплитудного набухания митохондрий ни в отсутствие, ни в присутствии ЕТН129.

Пальм Мтх 50 мкМ Атр 60 мкМ Мтх ПК+М Пальм 300 20 мМ мкМ Время, мин Рис. 4. Влияние пальмитиновой кислоты (Пальм) и атрактилозида (Атр) на дыхание митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Trisфосфатный буфер рН 7,2 – 7,4, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. (1) – митохондрии в среде без субстрата дыхания, где указано, добавлены пальмитиновая кислота (Пальм); (2) – пируват + малат (ПК+М), пальмитиновая кислота; (3) – пируват + малат, пальмитиновая кислота и атрактилозид (Атр).

Следовательно, митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены поры, зависимой от насыщенных жирных кислот и Сa2+. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий, без образования мегаканала. Таким образом, мы нашли, что в митохондриях Y.

lipolytica не индуцируется Сa2+-зависимая пора даже в присутствии Сa2+-ионофора ЕТН129, обеспечивающего поглощение митхондриями значительных количеств Сa2+.

Прооксиданты вызывают лишь снижение мембранного потенциала, но не образование мегаканала.

По данным Kowaltowski et al. (2001), сферопласты S. сerevisiae дикого типа были устойчивы к высоким концентрациям Са2+, Pн или t-бутилпероксида, однако мембранный потенциал снижался в присутствии высоких (0,5 мМ) концентраций Ca2+ и гидрофобного Поглощение кислорода, нА дитиолсвязывающего агента фениларсеноксида (ФАО). Это дало основание авторам утверждать, что в митохондриях S. сerevisiae может индуцироваться Са2+-зависимая пора.

Однако в работе отсутствовали контроли – как действуют прооксиданты без добавления Ca2+ и происходит ли набухание митохондрий или выход локализованных в митохондриях соединений.

Пальм БСА КЦХФ 10 мкМ 1 мг/мл 25 нМ 0.0.ETH Ca2+ 0.3 мкМ 30 мкМ 0.0.Мтх -0.0 200 400 Время, сек.

Рис. 5. Влияние пальмитата (Пальм), ETH129 (ETH), Сa2+ и бычьего сывороточного альбумина, свободного от жирных кислот (БСА), на генерацию мембранного потенциала митохондриями дрожжей Y. lipolytica. Состав среды инкубации см. рис. 1. Где указано, добавлен КЦХФ.

В качестве первого шага в работе было исследовано влияние прооксидантов на энергетические параметры митохондрий. В качестве прооксидантов использовали:

фениларзиноксид (гидрофобный бифункциональный SH-агент), менадион (гидрофильный монофункциональный SH-агент), оксалоацетат (окислитель эндогенного пула NADH) и некоторые другие прооксиданты (например, диамид).

Было найдено, что прооксиданты по-разному действовали на скорость дыхания дрожжевых митохондрий. Диамид в концентрации до 50 мМ и оксалоацетат в концентрациях 5 – 15 мМ не влияли на скорость дыхания, а также мембранный потенциал митохондрий.

Менадион вызывал разобщение митохондрий, его “разобщающее” действие частично Мембранный потенциал (511-533 нм) снижалось или предотвращалось водорастворимым антиоксидантом N-ацетилцистеином.

Фениларсиноксид ингибировал дыхание митохондрий, причем тем больше, чем выше была его концентрация.

Было исследовано влияние прооксидантов на мембранный потенциал митохондрий.

Оксалоацетат, как указано выше, не вызывал снижения мембранного потенциала в концентрациях 15 – 20 мМ при окислении митохондриями сукцината или пирувата + малата.

Менадион и фениларсиноксид, напротив, снижали мембранный потенциал, генерируемый дрожжевыми митохондриями при окислении сукцината или пирувата + малата, однако концентрации, вызывающие деполяризацию мембраны, были по крайней мере на порядок выше тех, которые оказывали аналогичный эффект на митохондрии животных.

Для того чтобы избежать заметного разобщения или ингибирующего действия на дыхание, мы эмпирически подобрали такую комбинацию прооксидантов (менадиона, фениларзиноксида и оксалоацетата), которые вместе, но уже в относительно низких концентрациях, вызывали деполяризацию дрожжевых митохондрий (Рис. 6).

ФАО 30 мкМ Мен 30 мкМ КЦХФ 25 нМ ОА 3 мМ 0,0,0,0,N-Aц 5 мМ Мтх -0,0 100 200 300 400 500 Время, сек Рис. 6. Совместное действие фениларсиноксида (ФАО), менадиона (Мен) и оксалоацетата (ОА) на величину мембранного потенциала митохондрий дрожжей Y. lipolytica «Ресопрягающий» эффект N-Ацетилцистеина (N-Ац). Среда инкубации как на рис. 1. Где указано, добавлен КЦХФ.

Мембранный потенциал (511-533 нм) Было обнаружено, что деполяризация мембраны, вызванная добавлением одного или нескольких прооксидантов, полностью снималась или предотвращалась N-ацетилцистеином и ATP (Рис. 6 и 7) и частично восстановленным глутатионом (не показано). “Ресопрягающее” действие ATP было специфичным, поскольку снималось карбоксиатрактилозидом, ингибитором транслоказы адениновых нуклеотидов, а также Mg2+. Другие использованные нуклеотиды оказывали частичный “ресопрягающий” эффект (Рис. 7).

Мен 30 мкМ КЦХФ 25 нМ ОА 3 мМ ФАО 30 мкМ 0.ATP 50 мкМ ADP 50 мкМ GTP 50 мкМ 0.12 0.0.N-Aц 5 мМ Олиго 20 мкг/мл 0.Мтх -0.0 100 200 300 Время, сек Рис. 7. «Ресопрягающий» эффект (1) – ATP, (2) – ADP, (3) – GTP на деполяризацию мембраны митохондрий Y. lipolytica, вызванную совместным действием фениларсиноксида (ФАО), менадиона (Мен) и оксалоацетата (ОА). Среда инкубации см. рис. 1. Где указано, добавлены: олигомицин (Олиго) ко всем, кроме АТР – (1), N-Ацетилцистеин (N-Ац) и КЦХФ.

Было исследовано совместное действие прооксидантов и кальция (в присутствии ЕТН129) на митохондрии дрожжей Y. lipolytica. Наблюдалась незначительная стимуляция или ингибирование дыхания митохондрий (в зависимости от используемого прооксиданта), а также связанная с этим деполяризация мембраны. Прооксиданты, порознь, или в комбинации друг с другом, или с Ca2+ и ЕТН129, не вызывали высокоамплитудного набухания дрожжевых митохондрий.

Таким образом, в митохондриях дрожжей Y. lipolytica прооксиданты порознь или в Мембранный потенциал (511-533 нм) комбинации друг с другом и Ca2+ вызывали снижение мембранного потенциала, но не образование мегаканала В митохондриях Y. lipolytica обнаружен К+-канал, закрываемый при добавлении ATP В митохондриях S. cerevisiae была обнаружена неспецифическая пора (названная также YMUC – yeast mitochondrial unspecific channel – дрожжевым митохондриальным неспецифическим каналом), открываемая, в противоположность митоК+ATP каналу митохондрий животных, в ответ на добавление ATP и закрываемая при дефиците ATP.

YMUC имеет, по-видимому, те же размеры, что и mPTP животных, и активен in situ (Manon S. et. al., 1998). Поэтому мы попытались установить, содержат ли прочно-сопряженные митохондрии дрожжей Y. lipolytica канал такого типа. Однако, мы обнаружили, что добавление 2 мМ ATP, вызывавшее высокоамплитудное набухание митохондрий S. cerevisiae (Jung, D.W., et al, 1997), не вызывало набухания митохондрий дрожжей Y. lipolytica, напротив, имело место ингибирование спонтанного набухания органелл (Рис. 8, кривая 2). Отсутствие ATP-индуцируемого набухания не было связано со структурными ограничениями, так как добавление каналоформера аламетицина (Рис. 8, кривая 3) или калиевого ионофора валиномицина (Рис. 9, кривые 1 и 2) приводило к высокоамплитудному (максимально возможному) набуханию митохондрий. Это наблюдение побудило нас подробнее исследовать влияние ATP на набухание митохондрий Y. lipolytica.

Набухание имело место в KCl-среде (Рис. 9, кривая 1) и ингибировалось добавлением АТР (Рис. 9, кривая 2) c величиной (I50), равной 48 мкМ. Ингибирующий эффект ATP частично предотвращался неорганическим фосфатом (Pн) (Рис. 9, кривая 4) и Mg2+ (Рис. 9, кривая 3). В присутствии этих реагентов величина I50 для АТР увеличивалась соответственно до 0,4 и 1,8 мМ.

Атрактилозид – ингибитор транслоказы адениновых нуклеотидов и олигомицин – ингибитор синтеза АТР частично предотвращали ингибирующий эффект АТР, причем атрактилозид в большей степени, чем олигомицин, что позволяет предположить, что АТР действует главным образом с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны.

Амплитуда набухания в KCl-среде была наибольшей при рН 7,5 (она была сопоставима с амплитудой набухания, вызываемой добавлением аламетицина) и уменьшалась примерно на 25-27% при снижении величины рН до 6,4.

0.ATP 2 мМ 0.0.0.Алам 2,6 мкг/мл 0.0.0 50 100 150 200 250 Время, сек Рис. 8. Влияние ATP (2) и аламетицина (Алам) (3) на набухание митохондрий Y.

lipolytica в среде [Jung et al., 1997], содержащей 230 мМ маннит, 70 мМ сахарозу, 10 мМ НЕРЕS (К+), рН 7,3, 25 мкМ ЭГТА, 0,5 мг/мл БСА, 10 мкг/мл олигомицина, 0,5 мг/мл митохондриального белка. (1) – митохондрии в среде инкубации.

Для того чтобы выяснить, селективен ли канал для ионов калия, мы исследовали набухание митохондрий Y. lipolytica в присутствии эквимолярных концентраций хлоридов K+, Na+, Li+, TEA+, Tris. Амплитуда набухания дрожжевых митохондрий была максимальной в 0,2 М KCl (принята за 100%) и составляла примерно 50% от максимальной в NaCl- и LiClсредах, 25% – в Tris-HCl-среде и около 10-15% в TEA-Cl-среде. Таким образом, можно утверждать, что ATP ингибировал пору (канал), индуцируемую главным образом моновалентными катионами, преимущественно K+.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»