WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Ковалёва Мария Владимировна ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA Специальность 03.00.04 – «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2009

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.Д. Миронова доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «17» декабря 2009 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 стр. 1

Автореферат разослан 16.10.2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования последнего десятилетия привели к осознанию того, что митохондрии, по крайней мере, в клетках высших эукариот, помимо их известной роли в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в индукции апоптоза. Изучению апоптоза придается большое значение, так как этот процесс является важнейшей составляющей процессов онтогенеза, морфогенеза, противоопухолевой и противовирусной защиты организма. В ряде случаев, напротив, он лежит в основе патогенетических механизмов, как это происходит при септическом шоке, инфаркте миокарда, инсульте, нейродегенеративных заболеваниях и т.д.

До недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь многоклеточным организмам, обладающим способностью к цитологической дифференцировке. Первое указание на возможность клеточной смерти дрожжей по механизму, напоминающему апоптоз, пришло из экспериментов, в которых животные про- или анти-апоптотические белки были гетерологически экспрессированы в дрожжах S. cerevisiae и изучено их влияние на клеточную физиологию (Priault, M. et.al., 2003). В этих опытах дрожжевые клетки либо умирали, демонстрируя набор физиологических маркеров апоптоза, либо избегали смерти, в зависимости от присутствия про- или анти-апоптотических белков. В дальнейшем в геноме различных видов дрожжей были обнаружены эндогенные гены-гомологи факторов апоптоза человека и животных. В 2002 г. в дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован и первый белок, участвующий в эффекторной стадии апоптоза у дрожжей – метакаспаза-1 (Madeo, F.

et. al., 2002) (Yca1p) - цистеиновая протеаза, функционально аналогичная митохондриальным каспазам животных.

С тех пор были получены многочисленные доказательства смерти дрожжевых клеток (в основном, S. cerevisiae) по механизму апоптоза как в ответ на внешние стимулы или повреждения клеточных структур, так и в результате репликативного или хронологического старения (Laun, P. et. al., 2006, 2008; Herker, E. et. al., 2004). При этом наряду с метакаспазой-в них доказано участие белков-гомологов факторов апоптоза человека: HtrA2 (Fahrenkrog, B.

et. al., 2004), AIF и AMID (Wissing, S. et. al., 2004); Dnm1p (Fannjiang, Y. et. al., 2004), ответственного за дробление митохондрий человека, цитохрома с (Ludovico, P. et. al., 2002;

Silva, R.D. et. al., 2005), эндонуклеазы G (Bttner, S. et. al., 2007; Cymerman, I.A. et. al., 2008), Rho5 GTPазы (при апоптозе, запускаемом активными формами кислорода) (Singh, K. et. al., 2008) и пока единственного известного антиапоптотического фактора Bir1p (Owsianowski, E.

et. al., 2008).

Совокупность этих данных можно рассматривать как веское указание на то, что программа апоптоза дрожжей и животных может иметь общие элементы. Особая роль митохондрий в системе выбора клетки между жизнью и смертью определяется тем, что они являются и основными генераторами активных форм кислорода в клетке, а их межмембранное пространство служит депо проапоптотических факторов. При повреждении внешней мембраны проапоптотические факторы выходят из митохондрий в цитоплазму, запускают и усиливают каскад реакций, приводящий в конечном итоге к гибели клетки. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов в цитоплазму. Один из них включает активацию, конформационную перестройку и интеграцию во внешнюю мембрану митохондрий проапоптотического белка Bax, члена семейства белков Bcl-2. Другим способом является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия пор.

В случае митохондрий дрожжей вопрос о механизмах выхода апоптотических факторов из митохондрий в цитоплазму изучен недостаточно. Твердо установлено лишь, что геном дрожжей не содержит генов белков семейства Bcl-2. Данные же относительно возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий фрагментарны и противоречивы.

Поэтому данная работа направлена на поиск и изучение способов (как ранее найденных в митохондрий животных, так и новых) индукции неспецифической проницаемости во внутренней митохондриальной мембране дрожжей. В качестве объекта исследования использовали дрожжи Yarrowia lipolytica, облигатные аэробы, содержащие полностью компетентную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического сопряжения и хорошо-структурированные кристы, поэтому являющиеся лучшей альтернативой более традиционному объекту изучения механизмов апоптоза у одноклеточных – митохондриям дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось систематическое исследование возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Y. lipolytica, определение условий индукции проницаемости и изучение её регуляции.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать противоречивые литературные данные о существовании неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей.

2. Исследовать возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны классического типа (Са2+-фосфат-зависимый, циклоспорин Ачувствительный механизм).

3. Изучить существование в митохондриях дрожжей Y. lipolytica иных механизмов индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны:

а) циклоспорин А-нечувствительного, индуцируемого низкими концентрациями Ca2+ и жирными кислотами;

б) запускаемого окислительным стрессом;

в) ATP-зависимого К+-специфичного ионного канала.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые на систематической основе исследована возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Y. lipolytica. Показано, что в исследованных митохондриях не индуцируется Са2+-фосфат-зависимая, циклоспоринчувствительная пора; пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipolytica без образования мегаканала. Обнаружен лишь ATPзависимый К+-канал, “животного” типа, специфически открываемый добавлением ATP.

Результаты настоящей диссертационной работы дополняют полученные к настоящему времени данные о возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей и её регуляции, и позволяют приблизиться к пониманию того, каким образом дрожжевые митохондрии могут принимать участие в процессе апоптоза.

Обнаруженное нами впервые сходство (митоКАТР) митохондрий животных и дрожжей Y. lipolytica позволяет рассматривать разработанную нами модель в качестве перспективной для изучения регуляции и структуры митохондриального К+-канала, которому в настоящее время отводится важная роль в защите сердечной мышцы от последствий ишемии.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (1 – 3 июня 2006, Москва, РФ); 14-й и 15й Европейских Биоэнергетических Конференциях (EBEC) (22 – 27 июля 2006, Москва, РФ);

32-ом, 33-м и 34-м FEBS Конгрессах (7 – 13 июля 2007, Вена, Австрия; 2008, Афины, Греция;

4 – 9 июля 2009, Прага, Чешская Республика); 24-й конференции «Дрожжевой транспорт и энергетика» (2006, 31 августа – 3 сентября, Прага, Чешская Республика); 2-м Съезде микологов России с международным участием “Современная микология в России” (11 – мая 2008, Москва, РФ).

Публикации. По материалам диссертационной работы имеется 1 публикация в J. Bioenerg. Biomembr., международном рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК РФ для защиты по специальности «биохимия», а также 9 тезисов докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и _ таблиц. Список цитируемой литературы включает наименований, в том числе _ на иностранных языках.

Сокращения, принятые в тексте.

МитоК+АТР – ATP-зависимый К+-канал митохондрий животных; mPTP – (mitochondrial permeability transition, pore) – неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны; – электрический трансмембранный потенциал; ЭГТА – этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый эфир)-N`,N`,N`,N`-тетрауксусная кислота; Рн – неорганический фосфат; КЦХФ – карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон; ЕТН129 – специфический кальциевый ионофор; БСАfaf – бычий сывороточный альбумин, свободный от примеси жирных кислот; TEACl – тетраэтиламмоний хлорид; 5-HD – 5-гидроксидекановая кислота.

Объект и методы исследования Организм и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Yarrowia.

lipolytica (Wick.) van der Walt and Arx, полученные из эпифитной микрофлоры листьев пустынных растений (пустыня Негев, Израиль) и идентифицированные на основании совокупности морфологических, физиологических, биохимических, хемотаксономических характеристик и молекулярно-генетического анализа как анаморфа Y. lipolytica (Zvyagilskaya, R, et. al., 2001). Клетки выращивали на 750-мл колбах Эрленмейера (рабочий объем – 100 мл) при 28 oC на роторной качалке (220 об/мин) на полусинтетической среде (Андреищева, Е.Н., et. al., 1997), содержавшей в качестве источника углерода и энергии 1%-ый сукцинат.

Выделение митохондрий осуществляли по методу, разработанному в нашей лаборатории и описанному ранее (Zvyagilskaya, R.A. et. al., 2004) с небольшими модификациями. Полученные митохондриальные препараты были полностью активны в течение, по крайней мере, 4 ч после выделения при хранении на льду.

Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке (рабочий объём 1 мл) c закрытым кислородным электродом типа Кларка. Основная среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 – 7,4, 20 мМ пируват, 5 мМ малат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл).

Потенциал, генерируемый на внутренней митохондриальной мембране, регистрировали на спектрофотометре Beckman coulter DU-650, используя двуволновой режим (511 – 533 нм) с сафранином О в качестве потенциал-зависимого зонда (Akerman, K.E.O., and Wikstrom, M.K.F., 1976). Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 – 7,3, 20 мМ пируват и 5 мМ малат или 20 мМ сукцинат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл).

Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония), по уменьшению оптической плотности митохондриальной суспензии при 540 нм.

Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд (Bradford, M.M., 1976) с БСА в качестве стандарта.

Результаты и их обсуждение Митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены «классической» Са2+-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры В работе использовали прочно-сопряженные митохондриальные препараты, выделенные из дрожжей Y. lipolytica. Они сохраняли регуляцию метаболического состояния, окисляли добавленные субстраты с высокими скоростями, высокими (порядка 4) величинами дыхательного контроля и величинами ADP/O, близкими к теоретически ожидаемым.

Митохондриальные препараты в присутствии экзогенных субстратов поддерживали неизменным в течение длительного времени (10 – 15 мин) и не набухали даже в гипотонической среде. Отсутствие набухания не было связано со структурными ограничениями, поскольку добавление аламетицина (который при встраивании в мембраны, образует поры диаметром 1 нм, способные пропускать низкомолекулярные вещества) вызывало высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий. Выделенные препараты митохондрий удовлетворяли и другим известным критериям физиологической интактности.

В соответствии с задачами исследования, мы исследовали чувствительность митохондрий Y. lipolytica к факторам, вызывающим образование классической mPTP в митохондриях животных. Об образовании пор(ы) судили, как это принято в литературе, по совокупности двух параметров – снижению мембранного потенциала () и высокоамплитудному набуханию митохондрий.

Прежде всего, мы нашли, что прочно-сопряженные митохондрии Y. lipolytica лишены природной системы транспорта Ca2+. Они не транспортировали Ca2+ даже в присутствии спермина, ADP, NADH, которые существенно улучшают кинетические параметры кальциевого унипортера в митохондриях животных. Митохондрии Y. lipolytica оказались устойчивыми к действию повышенных концентраций Ca2+, даже в присутствии микромолярных концентраций ЭГТА (Рис. 1), добавляемых к митохондриям животных для предотвращения обратимой активности Ca2+ унипортера и тем самым для достижения высокой [Ca2+] в митохондриальном матриксе, необходимой для открытия mPTP.

Са2+ Са2+ Са2+ КЦХФ 300 мкМ 300 мкМ 400 мкМ 25 нМ 0.0.Р ЭГТА н 2 мМ 0.08 25 мкМ 0.0.Мтх -0.0 100 200 300 400 500 Время, сек Рис. 1. Влияние Ca2+ на мембранный потенциал митохондрий дрожжей Y. lipolytica.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»