WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Анализ второй координационной сферы меди Т1. Для выявления влияния остатков второй координационной сферы окружения иона меди Т1, сформированной в случае лакказы из C.hirsutus остатками Phe162, Cys205, Asn206, Phe330, Phe337, Ala390, Pro391, Gly392, Ala393, Pro394, His395, Pro396, Phe397, Thr428, His452, - 20 - Cys453, His454, Ile455, Asp456, Phe457, His458, Leu459 и Phe463, было проведено детальное сравнение структур исследованных в работе лакказ. Сравнение проводили путем наложения структур лакказ из C.hirsutus, C.maxima, R.lignosus и C.cinereus по ходу полипептидной цепи. Далее был произведен анализ местоположения и возможных взаимодействий этих аминокислотных остатков в наложенных структурах. В итоге были выделены места в структуре, отличающиеся у этих лакказ. Все эти отличия находятся в предполагаемом субстрат-связывающем кармане для фенольных субстратов.

Анализ окружения иона меди Т1 у лакказ C.hirsutus и C.maxima показал, что оно практически идентично. Было обнаружено лишь единственное отличие - это замена в лакказе из C.maxima остатка Asn206 на остаток аспарагиновой кислоты. При этом ОВП этих ферментов отличается на 50 мВ, что может быть объяснено этой заменой.

У других лакказ, рассматриваемых в работе, в данном положении находится остаток аспарагиновой кислоты (рис. 1). Этот остаток аспартата (аспарагина) принимает участие в связывании фенольных субстратов. Исключение составляет лишь фермент из R.lignosus, в котором в этом положении обнаружен фенилаланин. Для этой лакказы замена аспартата на фенилаланин сопряжена с заменой Phe(нумерация по последовательности лакказы из C.hirsutus), характерного для остальных исследуемых в работе лакказ, на остаток аспарагина, Этот остаток в лакказе из R.lignosus играет роль якорного остатка в субстратсвязывающем кармане.

Рис.7. Петли, формирующие вход в субстрат-связывающий карман лакказы. Желтый цвет - структура C.hirsutus, зеленый цвет - структура C.cinereus.

Сравнение структур показало большие отличия у высоко и средне потенциальных лакказ в петлях, формирующих вход в субстрат-связывающий карман (остатки 157-161, 332-343, 386-394, нумерация по последовательности лакказы из C.hirsutus) (рис. 7). Для всех высоко редокс-потенциальных ферментов - 21 - положение и состав этих петель являются высокогомологичным, в отличие от средне редокс-потенциальных, где в зависимости от фермента могут наблюдаться отличия как по составу, так и по положению этих петель.

ВЫВОДЫ 1. Определены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности пяти высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A.faginea(T.versicolor) и одной средне редокспотенциальной из P.ostreatus.

2. Определена экзон-интронная структура генов лакказ. Показано, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 8-10 интронов, в то время как средне редокс-потенциальные более 10. Для всех базидиальных грибов обнаружено наличие трех интронов в положениях 80, 90 и 210. Установлены интроны, характерные только для высоко редокс-потенциальных лакказ (положения 160, 240, 330 и 370).

3. Определено филогенетическое положение исследуемых штаммов базидиомицетов.

5. Проведено сравнение центров Т1 высоко и средне редокс-потенциальных лакказ, структуры которых получены РСА и математическим моделированием.

Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении 206 остатков аспарагина или аспартата, а также наличие в структуре водородной связи между остатками Glu460 и Ser113.

6. Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Lyashenko AV, Zhukhlistova NE, Gabdoulkhakov AG, Zhukova YN, Voelter W, Zaitsev VN, Bento I, Stepanova EV, Kachalova GS, Koroleva OV, Cherkashyn EA, Tishkov VI, Lamzin VS, Schirwitz K, Morgunova EY, Betzel C, Lindley PF, Mikhailov AM. Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima.// Acta Crystallogr., Sect F. 2006, V.62, pp. 954-7.

2. E. A. Черкашин, Е. В. Степанова, Е. O. Ландесман, O. В. Королева, В. И.

Тишков. Сравнительный анализ последовательностей генов трех высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов.// Доклады Академии Наук, 2007, Т. 417, с. 348–351.

- 22 - Тезисы 1. Черкашин Е.А., Степанова Е.В., Королева О.В., Тишков В.И. Клонирование гена лакказы из базидиомицета Cerrena maxima.// Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов – 2006». М., 2006, с. 61.

2. Черкашин Е.А., Степанова Е.В., Королева О.В., Тишков В.И. Сравнительный анализ последовательности генов трех лакказ из базидиомицетов Cerrena maxima, Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus.// Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов – 2007». М., 2007, с. 472.

3. Cherkashyn E.A., Stepanova E.V., Landesman E.O., Koroleva O.V., Tishkov V.I.

Comparative analysis of full gene sequences of laccases from white-rot fungi Cerrena maxima, Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus. // The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development”. М., 2007, р.

267.

4. Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Landesman, Е.О., Tishkov V.I., Koroleva О.V.

Gene structure analysis of high redox potential laccases from basidiomycetes Cerrena maxima, Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus.// XV Congress of European Mycologists.

S.-Pb. 2007, p. 184.

5. Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Landesman, Е.О., Koroleva О.V., Tishkov V.I.

Сomparative analysis of gene sequences of three high redox potential laccases from basidiomycetes. //Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetic. Kiev, 2007, p. 55.

6. Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Landesman, Е.О., Koroleva О.V., Tishkov V.I.

Comparative analysis of gene sequences of three high redox potential laccases from basidiomycetes Cerrena maxima, Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus.// Abstracts of International Conference «Biocatalysis-2007» M. 2007, p. 89.

7. Королева О.В., Степанова Е.В., Курзеев С.А., Черкашин Е.А., Федорова Т.В., Поляков К.М., Тишков В.И. Молекулярная и структурная организация «голубых» лакказ.// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов.

Новосибирск 2008, с. 40.

8. Koroleva O.V., Polyakov K.M., Kurzeev S.A., Fedorova T.V., Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Tishkov V.I. Comparative analysis of 3D structures of laccases from Coriolus hirsutus at resolution 1.85 and 1.2. // 4th European meeting in Oxizymes.

Helsinki, 2008.

9. Koroleva O.V., Loginov D.S., Cherkashin E.A., Fedorova T.V., Stepanova E.V., Chulkin A.M., Abianova A.R., Vavilova E.A., Benevolensky S.V. Novel approaches for design of industrial enzymes.// The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology:

State of the art and prospects of development”. М., 2009, р. 274.

- 23 -

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»