WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |
C.hir 281 YDGAPAVEPT TNQTTSVKPL NEVDLHPLVS TPVPGSPSSG GVDKAINMAF NFNGSNF--F INGASFVPPT VPVLLQILSG AQTAQDLLPS GSVYVLPSNA C.max 281.........................................................--......................................... C.zon 276.....P.....V.PP..I.M V.A..TTFEE R.A....VP....L.L...........--..................V....A...........S..... A.fag 281....A.I....T....TQ.....N.....A.A.....VA....L..........T..--.......T..........I....N...........S..... C.ful 281.....P.....V.PP..I.M V.A..TTFDE R.A..R.VP....L.L.LL. S......--.......................A...........S..A.. P.ost 289.A..TEDD...TSS..T-.. E.TN.V.PEN PGA..PAVP..A.IN..L.M A.DVT..ELT...SP.KA.. A..........T..AS......I.S.EASK R.lig 287.Q..AVA....S.NSGT-A...AN.I..IN PGA..N.VP..A.INL.LRI GR.ATTADFT....P.I............. VTNPN....G.A.IS..A.Q C.cin 284.A..ANAD...SANPNPAQ...A...A.ID PAA..I.TP. AA.VNLRFQL G.S.GR.--T...TAYES.S..T....M....S.N....A....E..R.Q C.hir 379 SIEISFPATA AAPGAPHPFH LHGHTFAVVR SAGSTVYNYD NPIFRDVVST GTPAAGDNVT IRFDTNNPGP WFLHCHIDFH LEGGFAVVMA EDTPDVKAVN C.max 379.................................................................................................... C.zon 374 D....L..S.....F...................ST...A..VY.......S.--........R.D................A.........I...A... A.fag 379 D........T..............A......................................R.D................A.....F...I...ASA. C.ful 379 D....L..S.....F...................ST...A..VY.......S.--........R.D................A.........I...A... P.ost 388 VV...I..L. -–V.G...........D.I......T..F. T.AR....N...D-.N.......V.D............W...I.L...F...VTSIT.P- R.lig 386 V....I.G-- ---.GN........N.D... TP..S....V..VR.....I.GG--..... F..V.D............W...A.L...F...I.NIPIA. C.cin 382 VV.LVV..G- -VL.G.........A.S.......ST..FV..VK.....L.VT--..E.....V.D......F....E...MN.L.I.F...MANTVDA. C.hir 479 PVPQAWSDLC PTYDALDPND Q----- C.max 479...............----- ------ C.zon 472.............------- ------ A.fag 479...........I......S..----- C.ful 477.............N.......----- P.ost 483 --.A..D....I....SDS. KGGIA- R.lig 479 AISP..D....K.N.NN.DS GLA--- C.cin 478 NP.VE.AQ.. EI..D.P.EA TSIQTV Рис.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей лакказ.

- 14 40 50 80 110 120 130 140..|....|....|..|....|.......|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..

C.hirsutus VSPDGFSRQ----AVNIXXXXGDRTSIXXXXHWHGFFQHGTNWAD----GPAFINQCPISPGHSFL----YNFQVP C.maxima VSPDGFSRQ----AVNIXXXXGDRTSIXXXXHWHGFFQHGTNWAD----GPAFINQCPISPGHSFL----YDFQVP C.zonatus ISPDGFSRD----AVNKXXXXGDNTSIXXXXHWHGFFQKGTNWAD----GPAFVNQCPISAGNSFL----YDFQVP C.fulvocinerea ISPDGFSRQ----AVNKXXXXGDRTSIXXXXHWHGFFQKGTNWAD----GPAFVNQCPISAGNSFL----YDFQVP A.faginea VSPDGFSRQ----AVNKXXXXGDNTSIXXXXHWHGFFQKGTNWAD----GPAFINQCPISSGNSFL----YNFQVP P.ostreatus VSPDGFTRSXXXXAVNKXXXXGDNTSIXXXXHWHGFFQSGSTWADXXXXGPAFVNQCPIASGNSFLXXXXYDFNVP 160 180 210 220 230 270..|....|.....|....|.......|....|....|....|....|....|....|...|....|.......|.

C.hirsutus DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHTAAKLGPRFPXXXXGGAGKRXXXXYRSVNSQP C.maxima DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHTAAKLGPRFPXXXXLGAGKRXXXXYRSVNSQP C.zonatus DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHVAAKLGPAIPXXXXGGAGKR----YRSVNTQP C.fulvocinerea DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHTAAKLGPRFPXXXXLGAGKRXXXXYRSVNSQP A.faginea DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHVAAKLGPAFPXXXXLGAGKRXXXXYRSINTQP P.ostreatus DQAGTFXXXXWYPFIVXXXXYDNXXXXADTIITLEDWXXXXYHVVAPQNAVLPT-----ANKR----YRAVNIVP 310 320 330 340 350 360 410...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.....|....|.|....|....

C.hirsutus LE-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLDANQAVDNYWIRANPNFGNV----GFNGPVXXXXPGSPSFXXXXNGSNF C.maxima LE-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLDANQAVDNYWIRANPNFGNV----GFNGPVXXXXPGSPSFXXXXNGSNF C.zonatus LV-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLDANQAVNNYWIRANPNFGNV----GFTGPAXXXXPGSPVFXXXXNGSNF C.fulvocinerea LE-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXVVADQPVNNYWIRANPNVGNK----GFTGPAXXXXPGRPVFXXXXNGSNF A.faginea LV-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLEANQAVDNYWIRANPNFGNV----GFTGAVXXXXPGSPVFN----GTNF P.ostreatus IVXXXXXVDSIQIFAXXXXGQRYSFVLNANQTVDNYWIRADPNLGSTXXXXGFDG--NPGAPGPAVFDVTNFELTI 440 450 500 510 560 570 580 590 |....|....|....|.....|....|....|....|....|....|....|....|....|...|....|....| C.hirsutus FIN---GASFVPPT----VPAPG--APHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEG----GFATPDVKAVN-PVP C.maxima FIN---GASFVPPT----VPAPG--APHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEG----GFATPDVKAVN-PVP C.zonatus FIN---GASFVPPT----VPAPG--FPHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEA----GFAIPDVAAVN-PVP C.fulvocinerea FIN---GASFVPPT----VPAPG--FPHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEA----GFAIPDVAAVN-PVP A.faginea FIN---GASFTPPT----VPAPG--APHPFHLHG----HAWFLHC----HIDFHLEA----GFAIPDVASAN-PVP P.ostreatus NXXXXXGSPFKAPTXXXXAPGGPXXXXHPFHLHGXXXXHTWFLHCXXXXHIDWHLEIXXXXGLAVTSITAPPXXXX Рис.2. Экзон-интронная структура исследуемых лакказ.

- 15 Определение видовой принадлежности базидиальных грибов. Поскольку из семи базидиальных штаммов, продуцирующих лакказу при росте на жидких и твердых средах (согласно данным из коллекционного фонда - ЛЕБИН), X.radicata не содержала ген лакказы, а в случае P.ostreatus и A.faginea гены лакказ были гомологичны генам, кодирующим данный фермент из других базидиомицетов, было проведено определение видовой принадлежности базидиомицетов методом ДНК-типирования. Для проведения ПЦР с хромосомной ДНК исследуемых штаммов были использованы праймеры на консервативные участки генов рибосом ITS1F и ITS4B (рис. 3).

ПЦР-продукты были секвенированы, и полученные нуклеотидные последовательности ДНК сравнивались с последовательностями, имеющимися в банке данных GenBank с целью определения наиболее близкородственного штамма к исследуемому организму. В случае, если уровень гомологии превышал 98%, можно сделать вывод, что исследуемый штамм идентичен имеющемуся в банке данных. В результате была определена видовая принадлежность следующих штаммов базидиальных грибов (табл. 6) Название Последовательность ITS1F 5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3’ ITS4B 5’- CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG -3’ Рис. 3. Схема кластера ДНК, кодирующего рибосомальные субъединицы.

Стрелками обозначены праймеры для ПЦР.

.

Таблица Таксономическое определение штаммов базидиальных грибов.

Название Наиболее гомологичный Уровень используемое в штамм из базы данных гомологии коллекции ЛЕБИН (Taxonomy ID) Coriolus hirsutus Trametes hirsuta (5327) 100% Coriolus zonatus Trametes ochracea (230624) 100% Cerrena maxima Trametes maxima (259368) 100% Coriolus fulvocinerea Coriolopsis caperata (195176) 99% Pleurotus ostreatus Pleurotus sp. 'Florida' (188765) 99% Antrodiella faginea Trametes versicolor(5325) 100% Xerula radicata Xerula radicata (170858) 100% - 16 - Для базидиомицетов P.ostreatus и A.faginea эти данные хорошо согласуются с результатами клонирования генов лакказ, что позволило выдвинуть предположение об ошибочном определении видовой принадлежности по данным морфологических исследований и анализу характера базидиом.

Структурные исследования лакказ. В результате проведенных экспериментов по кристаллизации исследуемых в работе лакказ, были получены кристаллы трех лакказ C.hirsutus, C.maxima и C.zonatus, пригодные для РСА.

Получить кристаллы лакказ из C.fulvocinerea и P.ostreatus не удалось, что может быть связано с высокой степенью гликозилирования этих ферментов. Проведенный рентгено-структурный анализ выращенных кристаллов позволил получить трехмерные структуры ферментов. Для C.hirsutus были получены две структуры с разрешениями 1.8 (рис. 4) и 1.2, в случае структур лакказ из C.maxima и C.zonatus достигнутое разрешение составило 1.9 и 2.6 соответственно. Наложение основного хода полипептидной цепи и анализ аминокислотного окружения активных центров показали высокую степень сходства всех трех структур.

Рис. 4. Структура лакказы из C.hisutus, полученная с разрешением 1.8.

Поскольку трехмерная структура для лакказы из T.versicolor была получена ранее (PDB1GYC), а уровень гомологии полученной аминокислотной последовательности и определенной по данным РСА составил 91%, то для дальнейшего анализа структуры активного центра использовали структуру фермента из T.versicolor.

Получить кристаллы лакказы из P.ostreatus и C.fulvocinerea не удалось, поэтому было проведено математическое моделирование данных структур на основе - 17 - опубликованных структур. Для этого из имеющихся в базе данных PDB (Protein data bank) структур ферментов были выделены наиболее гомологичные по аминокислотной последовательности структуры. Для моделирования структуры лакказы из P.ostreatus была использована структура фермента из T.versicolor (PDB1GYC), полученная с разрешением 1.9. Уровень аминокислотной гомологии между лакказами из P.ostreatus и T.versicolor составил 66%. Моделирование лакказы из C.fulvocinerea проводили на основе структуры из C.hirsuta (PDB3FPX), полученной с разрешением 1.8. Данная структура была выбрана как модельная, поскольку уровень аминокислотной гомологии между ферментами из C.fulvocinerea и C.hirsuta составил 86%.

Анализ аминокислотного окружения Т1 медного центра лакказ. Активный центр лакказ сформирован четырьмя ионами меди и состоит из двух медьсодержащих центров: мономолекулярного «голубого» иона меди (Т1 центр), координированного двумя остатками гистидина и одним остатком цистеина, и трехъядерного медного кластера Т2/Т3, который содержит один ион меди типа Т2, координированный двумя гистидинами, и два иона меди типа Т3, координированные тремя остатками гистидина каждый (рис. 5).

Рис. 5. Структуры каталитических центров Т1 и Т2/Т3 лакказы из C.hirsutus.

Эффективность катализа у лакказ зависит от окислительно-восстановительного потенциала иона меди Т1 (первичного акцептора электронов) и может быть обусловлена несколькими параметрами, главными из которых являются структура субстрат-связывающего кармана и состав формирующих его аминокислотных остатков, а также аминокислотного окружения иона меди Т1. Единого мнения по поводу того, какие же аминокислотные остатки могут оказывать существенное - 18 - влияние как на величину ОВП, так и на эффективность связывания субстратов, все еще не существует.

Для выявления аминокислотных остатков, которые могут влиять на ОВП, и как следствие, на каталитические свойства фермента, был произведен анализ аминокислотного окружения Т1 центра лакказ с использованием трехмерных структур ферментов. Для анализа использовали полученные в работе структуры высоко редокс-потенциальных лакказ из C.hirsutus (разрешение 1.2 и 1.85) C.maxima (разрешение 1.9), C.zonatus (разрешение 2.6) и T.versicolor (разрешение 1.9). Для анализа аминокислотного окружения Т1 центра были также использованы структуры двух средне редокс-потенциальных лакказ из R.lignosus (PDB1V10, разрешение 1.7) и C.cinereus (PDB1HFU, разрешение 1.68) с ОВП 700мВ и 550 мВ соответственно.

Наложение полипептидных цепей выбранных, а также смоделированных структур лакказ показало, что ход цепи этих ферментов практически полностью совпадает. Отличия наблюдаются лишь в нескольких местах, причем отличающиеся структурные элементы представлены в основном петлями. Ход полипептидной цепи непосредственно вблизи от активных центров практически идентичен.

В литературе были выдвинуты две гипотезы о влиянии аминокислотных остатков на ОВП меди Т1. Согласно первой гипотезе для высоко редокспотенциальных лакказ характерно наличие остатка фенилаланина в ближайшей координации иона меди Т1, в то время как для средне и низко редокспотенциальных в данном положении находится остаток лейцина или метионина.

Согласно второй гипотезе, различие в ОВП связано с существованием водородной связи между боковыми цепями остатка глутамата 460 (нумерация остатков приведена по последовательности лакказы из C.hirsutus) из третьего домена фермента и остатка серина 113, входящего в первый домен (рис. 5). Эта водородная связь может влиять на ОВП активного центра, поскольку с уменьшением ее длины подвижность петли, которая содержит глутамат 460 и координирующий ион меди Тгистидин 458 снижается. Данное взаимодействие наблюдается у лакказ из C.мaxima, C.hirsutus, C.zonatus, T.versicolor и R.lignosus, которые имеют ОВП 700-800 мВ, причем для высоко редокс-потенциальных ферментов при увеличении расстояния между этими остатками происходит уменьшение ОВП (рис. 6), однако прямой корреляции не наблюдается. У лакказы из C.cinereus, обладающей самым низким потенциалом из известных грибных ферментов, такое взаимодействие отсутствует, поскольку в данных положениях у нее находятся остатки глицина 113 и метионина 459 (нумерация остатков приведена по последовательности лакказы из C.cinereus).

- 19 - Расстояния ОВП Т1, Организм GluмВ Ser113,А C.zonatus 2.5 820±C.hirsutus 2.8 812±A.faginea 2.9 780±(T.versicolor) C.мaxima 2.9 750±R.lignosus 2.6 700±C.cinereus - 550±Рис. 6. Взаимодействие Glu460 и Ser113 вблизи активного центра T1 структуры C.hirsutus.

Ион меди в центре Т1 непосредственно координируется двумя остатками His395 и His458 и остатком Cys453, которые являются строго консервативными у всех лакказ. Кроме того, в ближайшую сферу окружения попадают также консервативный у всех лакказ остаток Ile455 и остаток Phe337 у высоко редокспотенциальных лакказ (нумерация остатков по последовательности лакказы из C.hirsutus), который замещен на остаток лейцина у средне редокс-потенциальных лакказ и на остаток метионина у низко редокс-потенциальных.

Аминокислотные остатки Phe337 (нумерация по последовательности лакказы C.hirsutus) и замещающий его остаток лейцина для высоко и средне редокс-потенциальных лакказ соответственно находятся на расстоянии превышающем 3,5 от иона меди Т1. Поэтому прямое взаимодействие с ионом меди представляется маловероятным, и, как следствие, наличие остатка фенилаланина в данном положении может быть только маркером для высоко редокс-потенциальных ферментов, но не одним из ключевых остатков, влияющим на ОВП лакказы. Это предположение было доказано в работе Ф. Ксу, показавшего отсутствие изменения редокс-потенциала лакказы из Myceliophthora thermophila при замене остатка метионина на остаток фенилаланина в этом положении.

Следовательно, для поиска аминокислотных остатков, которые могут оказывать влияние на ОВП, необходимо рассматривать вторичную сферу окружения активного центра Т1, а именно, остатки находящиеся на расстояниях до 8.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»