WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Участок аминокислотной последовательности C.hirsutus, полученный путем трансляции нуклеотидной последовательности с кДНК, был использован для поиска гомологичных аминокислотных последовательностей в базе данных GenBank.

Высокий уровень гомологии (более 90%) наблюдался для аминокислотных последовательностей высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.maxima и T.versicolor, определенных на основании данных рентгено-структурного анализа [PDB code:2H5U,1KYA]. Для конструирования праймеров был проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей этих лакказ и выявлены консервативные аминокислотные участки. На основе анализа и данных по частоте встречаемости кодонов для C.hirsutus, был проведен дизайн вырожденных праймеров, которые кодируют консервативные участки аминокислотной последовательности лакказ. Нуклеотидная последовательность лакказы из C.hirsutus, полученная секвенированием кДНК, и последовательность сигнального пептида для T.versicolor были использованы для синтеза вырожденного праймера, который с высокой степенью вероятности применим для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих сигнальные пептиды лакказ других штаммов.

Таким образом, были разработаны и синтезированы 8 праймеров для определения нуклеотидной последовательности лакказы из C.hirsutus, которые могут быть использованы и для определения нуклеотидных последовательностей других высоко потенциальных лакказ (табл. 2).

Разработанные праймеры были использованы для получения ПЦР-фрагментов, нуклеотидные последовательности которых были определены методом секвенирования. Поскольку не все пары праймеров давали выход целевого ПЦРпродукта, определить полную нуклеотидную последовательность гена лакказы не удалось, что вызвало необходимость синтеза дополнительных праймеров комплементарных к уже определенным участкам гена лакказы из C.hirsutus.

Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов, полученных с помощью дополнительных праймеров (табл. 3), позволили определить всю последовательность гена лакказы из C.hirsutus. Полная нуклеотидная последовательность гена лакказы имела длину 2120 пар нуклеотидов. По данным кДНК и рентгено-структурного анализа аминокислотная последовательность лакказы из C.hirsutus состоит из 500 аминокислотных остатков, что составляет 1500 пар нуклеотидов. Следовательно, 620 нуклеотидов в гене фермента локализованы в интронах, что составляет около 30% от общей длины последовательности.

Полученная таким образом нуклеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную. Для определения правильной рамки считывания при трансляции использовались аминокислотные последовательности, определенные с помощью - 8 - клонирования кДНК и рентгено-структурного анализа. Положение интронов локализовали на основании GT-AG сайтов сплайсинга в интронах [Mount S. et al., 1982]. Таким образом, установлено, что ген лакказы из C.hirsutus состоит из экзонов и 10 интронов.

Таблица Праймеры, использованные для клонирования генов высоко редокс-потенциальных лакказ.

Название Последовательность Сигнальный 5’- ATG TCG AGG TTT CAC TCT CT(TG) TTC (GA)C(TC) TTC пептид (GA)TC -3’ Lac1For N-конец гена 5’- GCC GAC CT(AC) ACC ATC ACC AAC GC -3’ Lac2For Lac3For 5’- CAC TGG CA(CT) GG(CT) TTC TTC CAG CA(GT) G-3’ Lac4For 5’- ACC TTC TGG TA(CT) CAC AGT CAC TTG TC(CG) AC- 3’ Lac4Rev 5'- GT (CG)GA CAA GTG ACT GTG (GA)TA CCA GAA GGT -3' Lac5For 5’-GT(CG) GAC TCC ATC CAG ATC TTC GC(GC) GC -3’ Lac5Rev 5'- GC (GC)GC GAA GAT CTG GAT GGA GTC (CG)AC -3' Lac6For 5’- CAC CC(GC) TTC CAC TTG CAC GG(GC) CAC- 3’ Lac6Rev 5'- GTG (GC)CC GTG CAA GTG GAA (GC)GG GTG -3' Lac7Rev 5'- C GAT GTG GCA GTG GAG GAA CCA (GC)GG -3' С-конец гена 5’- TTA CTG GTC (GA)CC (GC)GG (GC)GC GTT CG -3’ Lac8Rev Таблица Дополнительные праймеры для клонирования гена лакказы из C.hirsutus.

Название Последовательность 5’-ATG TCG AGG TTT CAG TCT CT(TG) CT(TG) AC(CG) TTC LacН1For ATC-3’ Lac9For 5'- ACC TTC AGC ATT GAT GGT CAC AAC TTG -3’ Lac10For 5'- CAG GAC CTC CTG CCC TCC GGC AGT GTA TAC -3' Lac11Rev 5'- CGC GTC GTA (GC)GT CGG GCA CAG GTC (CG)GA CCA -3' Lac8HRev 5’- TTA CTG GTC (GA)TT (GC)GG GTC (GC)AG CG -3’ - 9 - Определение полной аминокислотной последовательности высоко редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea. Для определения полной нуклеотидной последовательности лакказ из базидиомицетов C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea использовали ту же стратегию клонирования и те же праймеры, как и в случае лакказы из C.hirsutus.

В результате исследований было установлено, что гены лакказ из C.maxima и C.fulvocinerea содержат по 10 интронов каждый, а фермент из C.zonatus - интронов. Аминокислотная последовательность (без сигнального пептида) лакказы из C.maxima включает 499, а лакказ из C.fulvocinerea и C.zonatus - аминокислотных остатков. В случае лакказы из C.maxima удалось установить и последовательность сигнального пептида, длина которого составила аминокислотный остаток.

Определение аминокислотной последовательности средне редокспотенциальной лакказы из P.ostreatus. Для средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus использование праймеров для клонирования высоко редокспотенциальных лакказ не давало выхода целевого ПЦР-продукта, и в дальнейшей работе использовали универсальные праймеры для лакказ (табл. 1). Для пары праймеров LacA1 For- LacA4 Rev был получен ПЦР-фрагмент размером 1200 п.н.

Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он обладает 100% гомологией с лакказой POX1 [GenBank Accession code: Z22591] из Pleurotus sp. 'Florida'. Поэтому для разработки праймеров использовали имеющуюся в банке данных нуклеотидную последовательность лакказы POX1. В результате были синтезированы праймеры на 5’- и 3’- участки гена (табл. 4).

Таблица Праймеры, использованные для клонирования лакказы из P.ostreatus.

Название Последовательность Сигнальный пептид 5’-ATG TTT CCA GGC GCA CGG ATT CTС GC-3’ LacPO1 For LacPO4 For 5'-CCC AAT TTC ACG TTC TCG ATC GAC GGT CAC-3' LacPO4 Rev 5'- GTG ACC GTC GAT CGA GAA CGT GAA ATT GGG -3' LacPO5 For 5'-CCA CTT GAA AAT CCT GGT GCT CCT GG-3' LacPO5 Rev 5'-CCA GGA GCA CCA GGA TTT TCA AGT GG -3' С-конец гена 5'- CTA GAC TCG ATC TTA TGG AAA CG -3' LacPO11 Rev - 10 - Использование этих праймеров дало возможность определить нуклеотидную последовательность лакказы из P.ostreatus, которая полностью совпала с последовательностью лакказы POX1, определенной ранее [GenBank Accession code:

Z22591]. Длина нуклеотидной последовательности составляет 2756 п.н.

Аминокислотная последовательность лакказы была получена прямой трансляцией с нуклеотидной последовательности. Анализ полученной последовательности показал, что она содержит 20 экзонов и 19 интронов.

Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea Базидиомицет A.faginea, а так же экспрессируемая им лакказа, в литературе описаны ранее не были. Поэтому для определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности лакказы из этого организма использовалась методика инвертного ПЦР. Для реализации данного подхода ключевым шагом является определение нуклеотидной последовательности внутренней области ДНК исследуемого образца (300-500 п.н). В качестве праймеров для получения внутренней области гена использовали пару универсальных праймеров для лакказ- LacA1 For-Laca5 Rev. В результате амплификации были получены два ДНКфрагмента длиной около 1100 п.н. и 1300 п.н. После секвенирования этих фрагментов, были обнаружены значительные отличия в их нуклеотидной последовательности. Фрагмент размером 1100 п.н имел 94% гомологию с лакказой из T.versicolor [GenBank Accession code:AY081188]. Фрагмент размером 1300 п.н.

содержал многочисленные «вставки» в нуклеотидной последовательности, которые не встречались в полных нуклеотидных последовательностях генов изучаемых лакказ. Поэтому было проведено клонирование гена содержащего более легкий ПЦР-фрагмент. Для этого были разработаны и синтезированы новые праймеры, обеспечивающие проведение инвертного ПЦР (табл. 5).

Таблица Праймеры для проведения инвертного ПЦР (лакказа из A.faginea).

Название Последовательность LacAf1 For 5'-CGC AGT ACT GTG ACG GTC TGA GGG GGC-3' LacAf3 Rev 5'-TGG AGG TCA ACA TTG ACG CGT TAT GTC ACA ACA AAG-3' LacAf4 For 5'-TTC CAC TTG CAC GGT CAC GCG TTC GCC-3' LacAf1 Rev 5'-GCC CCC TCA GAC CGT CAC AGT ACT GCG-3' LacAf6 Rev 5'-GTT CAC CAC GAC GGC CTG GCG AGA AAA GC-3' Гидролиз геномной ДНК проводили рестриктазами HindIII, EcoRI, BamHI и Pst в стандартных условиях. В результате в случае рестриктаз HindIII и EcoRI при амплификации с инвертными праймерами были получены ПЦР-фрагменты, которые были высокогомологичны лакказе из T.versicolor. Таким образом, была полностью - 11 - определена нуклеотидная последовательность лакказы из A.faginea. Полученная нуклеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную. Анализ базы данных GenBank показал, что полученные нуклеотидная и аминокислотная последовательности были гомологичны на 94 и 98% соответствующим последовательностям лакказы из базидиомицета T.versicolor. Полная длина гена составила 2002 п.н., организованных в 9 экзонов и 8 интронов.

Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ.

Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ с последовательностями средне редокс-потенциальных лакказ из Coprinus cinereus и Rigidoporus lignosus приведено на (рис. 1). Видно, что высоко редокс-потенциальные ферменты имеют высокий уровень гомологии между собой (>80%). Средне редокспотенциальная лакказа из P.ostreatus имеет более низкий уровень гомологии 63% по аминокислотной последовательности по отношению к ферменту из C.hirsutus и характеризуется заметными отличиями (делеции/вставки) в аминокислотной последовательности. Различия имеют преимущественно точечный характер и, как показал анализ структур, находятся вдали от активного центра фермента.

Интересно также отметить, что дипептид Ala-Ala 452-453, который присутствует в лакказах из C.hirsutus, C.maxima и A.faginea (T.versicolor) характерен только для семейства Trametes (Coriolus).

Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ. Большинство нуклеотидных последовательностей генов лакказ, имеющихся в базе данных, получены секвенированием кДНК и не содержат интронов. Последовательностей, полученных клонированием с хромосомной ДНК, описано около 30. Анализ экзон-интронной структуры генов исследуемых лакказ показал, что для высоко редокс-потенциальных лакказ характерно наличие меньшего числа интронов (8-10), чем для средне редокс-потенциальных. Эти данные хорошо согласуются с результатами анализа экзон-интронной структуры для других высоко и средне редокс-потенциальных ферментов. Так средне редокс-потенциальные лакказы из С.cinereus, P.ostreatus (PoxC) и R.lignosus содержат 19, 21 и 12 интронов соответственно. Все исследованные в данной работе лакказы имеют в трех положениях интроны, идентичные по локализации и длине (положения 80, 90 и 210) (рис. 2). Анализ базы данных показал, что данные интроны характерны для всех базидиальных лакказ с описанной экзон-интронной структурой. У лакказ из аскомицетов интроны в данных положениях не обнаружены, что позволяет высказать предположение об общности экзон-интронного строения генов у базидиомицетов. Также следует отметить наличие у исследованных в данной работе высоко редокс-потенциальных лакказ четырех интронов, не характерных для средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus (положения 160, 240, 330 и 370) (рис. 2). Анализ последовательностей средне редокс-потенциальных лакказ из - 12 - T.pubescens (Lac1), L.tigrinus, R.lignosus, C.cinereus и G.lucidum показал отсутствие у них интронов в этих положениях это свидетельствует о том, что эти четыре интрона характерны только для высоко редокс-потенциальных лакказ.

- 13 - C.hir 1 -AVGPVADLT ITDAAVSPDG F-SRQAVVVN G--------- VTPGPLVAGN IGDRFQLNVI DNLTNHTMLK STSIHWHGFF QHGTNWADGP AFINQCPISP C.max 1 -....................-.........---------............................................................ C.zon 1 ------......N..I.....-..D......--------- GF....IT.. K..N..I........................K..........V......A A.fag 1 -GI......A.SN........-.........--------- G.....IT.. K..N...........................K.................S C.ful 1 -CI..I.....SN.DI.....-.........--------- G.....IT.. K..............................K..........V......A P.ost 1 -.I..TG.MY.VNED......-T.S...AR SDPTTNGTSE TLT.V..Q.. K..N.....L NQ.SDT.... T..........S.ST.......V.....AS R.lig 1 -.ATVAL..H.LN.NLD... TGA.S..TAE.--------- T.IA..IT...D....I....Q..DAN.RR A..........A..TEM.....V.....I. C.cin 1 AI.NS.DTM. L.N.N......-T.AGIL...--------- -VH...IR.G KN.N.E...V ND.D.P...R P.......L..R.......A DGV....... C.hir 90 GHSFLYDFQV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGPFVVYDP NDPHASRYDV DNDDTVITLA DWYH----TA AKLGPRFPGG ADATLINGKG RAPSDSPA-E C.max 90................................................................----..........L................TT.-. C.zon 85.N..............................................................----V......AI..............S..NLN.-. A.fag 90.N....N....................................S.DL.................----V......A..L............S..TTT.-D C.ful 90.N..............................................................----..........L................TT.-. P.ost 99.N......N..........................I.... S...L.L.....A..I...E....----VV.PQNAVL.T-..S........FAGGPTS-A R.lig 91 NE..V...V..G....Y................A..........L.L....DAS....I.....SLSTVL FPNPNKA.PA P.T.....L..NSANPS.GQ C.cin 90..A...K.TP AGH.........FG..........M.I..D.....AL..E.DEN.I........-----I PAPSIQGAAQ P..........YVGGPA.-. C.hir 185 LSVIKVTKGK RYRFRLVSLS CNPNHTFSID GHNLTIIEVD SVNSQPLEVD SIQIFAAQRY SFVLDANQAV DNYWIRANPN FGNVGFDG-- --GINSAILR C.max 185.....................D................................................................N.-- --........ C.zon 180.A..T................D..Y..................T...V...................... N...............T.-- --........ A.fag 185.A..S..A.............D..YV.......M....T..I.T...V................E.....................T.-- --........ C.ful 185.....................D...........W..........X..................VV.D.P. N......... V..K..T.-- --........ P.ost 193.A..N.ESN.......I.M..D..F.......S.QV..A. A..IV.IV........G.......N...T........D.. L.ST....-- --D....... R.lig 191.A.VS.QS.......I..T..F..YA......RM.V.... G.SH...T...LT...G....V.VE..... G........S N.RN..T.-- --......F. C.cin 184..IVN.EQ.. K..M..I....D..WQ......E....... GELTE.HT.. RL...TG...........P........Q.. K.RN.LA.TF AN.V......

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»