WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ЧЕРКАШИН Евгений Александрович СТРУКТУРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАККАЗ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в лаборатории «Молекулярные основы биотрансформаций» Учреждения Российской академии наук Института биохимии имени А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор В. И. Тишков доктор биологических наук, профессор О. В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А. П. Синицын доктор биологических наук А. А. Леонтьевский

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 18 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан “_” _2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф.Орловский - 2 - ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Разработка эффективных технологий «зеленой» химии, способных заменить существующие химические технологии, обуславливает возрастающее внимание к поиску ферментов и созданию на их основе альтернативных и новых биокаталитических процессов. Одним из таких ферментов является лакказа (п-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2). Лакказа принадлежит к семейству медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более ферментов этого типа из различных источников: грибов, растений, насекомых, бактерий. Большая часть лакказ выделена из базидиальных грибов, где этот фермент участвует в процессах деструкции лигнина, синтеза пигментов, детоксификации и синтеза гуминоподобных веществ. Функция лакказы в растениях связана с процессом образования лигнина. В насекомых лакказа участвует в процессе склеротизации, а также играет важную роль при окислении токсичных соединений. Согласно данным ряда исследователей лакказы или лакказоподобные ферменты присутствуют в бактериях и вовлечены в синтез белка оболочки эндоспор.

Наиболее консервативной частью лакказы является активный центр, содержащий четыре иона меди и координирующие их аминокислотные лиганды, формирующие уникальную структуру, определяющую спектральные и каталитические характеристики фермента. Следует отметить, что в процессе эволюции медьсодержащих белков архитектоника медных центров изменилась незначительно, что позволяет рассматривать активный центр лакказы как модельную систему для изучения механизма действия таких медьсодержащих оксидаз, как аскорбатоксидаза и церрулоплазмин.

Ионы меди в биологических системах классифицируют согласно их оптическим и магнитным свойствам на три типа: T1, Т2 и Т3. В активном центре лакказы присутствуют все три типа, однако, несмотря на консервативность его строения, каталитические характеристики различных лакказ значительно отличаются, что, по мнению ряда авторов, определяется значением как окислительновосстановительного потенциала иона меди первого типа, так и строением белковой и углеводной частей фермента. В этой связи, особый интерес для исследования представляет группа лакказ с высоким значением окислительно-восстановительного потенциала иона меди первого типа Т1.

В настоящее время получены и опубликованы данные по структуре более лакказ из различных источников. Однако даже наличие структурных данных все еще - 3 - не позволяет установить однозначную взаимосвязь между структурой фермента и механизмом его действия и ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы, такие как: 1) что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра (T1); 2) какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих этот центр; 3) что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях. Таким образом, изучение генетической организации лакказ и установление структурно-функциональных особенностей данных ферментов является актуальным как с фундаментальной (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (создание рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное изучение генетической и структурной организации высоко и средне редокс-потенциальных лакказ базидиомицетов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Клонирование генов лакказ из базидиомицетов Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolus zonatus, Coriolopsis fulvocinerea, Antrodiella faginea и Pleurotus ostreatus с хромосомной ДНК и определение их полных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей.

2) Определение экзон-интронной структуры генов исследуемых лакказ и их сравнительный анализ.

3) Уточнение ранее полученных структур базидиальных лакказ из C.hirsutus, C.maxima и C.zonatus на основе полученных аминокислотных последовательностей.

4) Моделирование структур лакказ из C.fulvocinerea и P.ostreatus на основе полученных аминокислотных последовательностей.

5) Структурный анализ окружения активного центра ионов меди Т1 и определение аминокислотных остатков, которые могут влиять на каталитические свойства фермента.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование геномной организации высоко и средне редокс-потенциальных лакказ из C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A.faginea и P.ostreatus. Установлено, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 9-10 интронов, причем их длина и положение совпадают. Средне редокс-потенциальные лакказы характеризуются наличием большего числа интронов. Высказана гипотеза о существовании консервативных и вариабельных интронов в генах лакказ базидиомицетов.

Установлена локализация трех интронов, характерная только для лакказ базидиальных грибов. Анализ базы данных GenBank подтвердил высказанную гипотезу. Показано, что разделение лакказ на группы в зависимости от величины окислительно-восстановительного потенциала подтверждается особенностями - 4 - генетической организации. Последовательность гена лакказы из C.hirsutus депонирована в банк данных [GenBank Accession code: ACC43989].

Проведен сравнительный анализ аминокислотных остатков в активном центре Т1. Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении остатков Asn или Asp, а так же наличие водородной связи между остатками Glu460 и Ser113 (нумерация остатков приведена по структуре лакказы C.hirsutus).

Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

Практическая значимость работы. Результаты сравнительного исследования генетической организации генов высоко и средне редокс-потенциальных лакказ очень важны для поиска штаммов-продуцентов высоко потенциальных лакказ.

Разработанные методы клонирования лакказ с хромосомной ДНК, являются быстрыми методами оценки типа лакказ (высоко, средне потенциальные), применимыми к широкому кругу базидиальных штаммов продуцентов. Проведенное исследование геномной организации лакказ является основой для проведения экспериментов по белковой инженерии данных ферментов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development” (Moscow, Russia, 2007), Международные конференции «Ломоносов – 2006», «Ломоносов – 2007» (Москва, Россия, 2006, 2007), 15 Международный микологический конгресс «XV Congress of Europian Mycologist» (C.-Петербург, Россия, 2007), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), Международная конференция «Биокатализ-2007» (С. -Петербург, Россия, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), 4th European meeting in Oxizymes (Helsinki, Finland, 2008), The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development” (Moscow, Russia, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 9 тезисов конференций. Обе статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация содержит_страниц печатного текста,_ рисунков, таблиц и _ ссылок.

- 5 - РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выбор штаммов для исследования. В качестве объекта исследования были выбраны следующие штаммы - продуценты лакказ из коллекции Ботанического Института им. Комарова РАН (ЛЕ(БИН)):

Coriolus hirsutus (Trametes hirsuta (Wulfen), Pilat, 1939);

Coriolus zonatus (Trametes ochracea (Pers.), Gilbe&Ryvarden, 1897);

Cerrena maxima (Trametes maxima (Mont.), A. David&Rajchenb, 1985);

Coriolopsis fulvocenerea (Coriolopsis caperata, Murrill, 1908);.

Pleurotus ostreatus ((Jacq.), P. Kumm&Pilzk,1871);

Androdiella faginea (Vampola et Pouzar, 1996);

Xerula radicata (Relhan&Drfelt, 1975).

Следует отметить, что классификация базидиальных грибов достаточно запутана и поэтому в работе будет использовано то название штамма, которое он имеет в коллекции ЛЕ(БИН)а со ссылкой на современное название согласно CABI Bioscience и базе данных CBS (www.indexfungorum.org).

По предварительным биохимическим исследованиям лакказы, продуцируемые базидиомицетами C. hirsutus, C.zonatus, C.maxima, A.faginea и C.fulvocenerea, являются высоко редокс-потенциальными и имеют потенциал иона меди Т1 > мВ [Buldrian P. et al., 2006]. В то время как лакказы, продуцируемые базидиомицетами P.ostreatus, и X.radicata, имеют средний редокс-потенциал.

Определение наличия генов лакказ в геномах базидиальных грибов.

Лакказы базидиальных грибов кодируются сложным семейством генов, причем в одном штамме может содержаться как один, так и несколько генов изоформ фермента. Несмотря на ограниченное количество публикаций о геномной организации грибных лакказ, общей чертой лакказных генов можно считать высокую гомологию участков нуклеотидной последовательности, кодирующих аминокислотное окружение ионов меди активного центра фермента. Проведенный анализ более 100 аминокислотных последовательностей лакказ, имеющихся в базе данных GenBank, позволил выделить 4 консервативных для всех лакказ участка, причем аминокислотные остатки, входящие в их состав, отвечали за координацию ионов меди. На основании нуклеотидных последовательностей этих участков были сконструированы и синтезированы праймеры (табл. 1).

Праймеры LacA1 For и LacA1L For были сконструированы на один и тоже же участок гена и отличались только в 6 триплете TT(TC) и (CT)T(GC) соответственно.

Синтез двух практически одинаковых праймеров обусловлен наличием с равной вероятностью в указанном положении как остатка фенилаланина, так и остатка лейцина.

- 6 - Таблица Универсальные праймеры на высоко консервативные участки гена лакказ.

Название Последовательность LacA1 For 5'-CA(CT) TGG CA(CT) GG(AT) TT(TC) TT(TC) CA(AG)-LacA1L For 5'-CA(CT) TGG CA(CT) GG(AT) TT(TC) (CT)T(GC) CA(AG)-3' LacA2 For 5'-T(TA)(TC) TGG TA(TC) CA(CT) (TA)(CG)T CA(CT) (CT)TA-3' 5'-(AG)TG (AT)CC (AG)TG (TA)AG (AG)TG (GA)AA (AT)GG LacA4 Rev (AG)TG-3' LacA5 Rev 5'-(AG)TG (AG)AA (AG)TC·(AGT)AT·(AG)TG·(AG)CA·(AG)TG-3' Вышеуказанные праймеры были использованы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на геномной ДНК исследуемых штаммов. В результате для всех исследуемых штаммов за исключением X.radicata были получены соответствующие ПЦР-продукты. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии генов лакказы у X.radicata. Для подтверждения результатов ПЦР, было проведено поверхностное и глубинное культивирование исследуемых штаммов на оптимизированной для максимальной продукции лакказ среде. Все изученные штаммы, за исключением X.radicata, секретировали при культивировании лакказу в культуральную жидкость, из которой были выделены очищенные препараты фермента.

Разработанная ПЦР-методика является универсальной для детекции генов лакказ в различных штаммах базидиомицетов и позволяет в короткий срок определять наличие или отсутствие гена лакказы, его частичную нуклеотидную последовательность, и, как следствие, оценить уровень гомологии этой последовательности с уже известными данными. Это позволяет применять ее для экспресс-метода поиска грибных продуцентов лакказ.

Неоспоримым достоинством данной методики, следует также считать, возможность определения с помощью инвертной ПЦР полной последовательности гена лакказы, включая интроны даже в случаях, когда неизвестны ни аминокислотная, ни нуклеотидная последовательности.

Определение полной нуклеотидной последовательности, с использованием геномной ДНК обладает рядом достоинств по сравнению с методом определения последовательности через клонирование кДНК, поскольку исключает возможные ошибки, которые могут возникнуть при проведении реакции обратной транскрипции.

Кроме того, данный метод позволяет определить экзон-интронную структуру гена лакказы.

Определение аминокислотной последовательности лакказы C.hirsutus клонированием гена с хромосомной ДНК. Для определения полной нуклеотидной - 7 - последовательности лакказы из базидиомицета C.hirsutus было проведено амплифицирование полноразмерного гена этого фермента с хромосомы при помощи ПЦР.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»