WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     ||
|

Экспериментальные данные по замедлению отмирания выживших после облучения клеток различных генотипов по сравнению с интактными клетками в данной диссертационной работе получены в диапазоне доз от 13 до 1200 Гр. Впервые явление замедления отмирания показано не только после предварительных малых доз, но и после воздействия в больших дозах, когда выживает малая часть популяции.

Рис. 1. А – зависимость отмирания контрольных () и облученных в дозе 130 Гр () дрожжевых клеток штамма Т1 в непитательной среде при 37оС. Б – та же зависимость при нормировании выжившей после облучения части популяции к 100 %. О показателях k и t см. в тексте В качестве основной количественной характеристики, отражающей процесс замедления гибели облученных клеток, введен коэффициент замедления отмирания клеток (k), определяемый отношением продолжительности отмирания облученных и контрольных клеток, рассчитанным для некоторого изоэффективного уровня (например, для выживаемости клеток, равной 10 %). Для сопоставления интервалов времени после облучения, в течение которого отмирание контрольной и облученной клеточных популяций происходит не по экспоненциальному закону, введен показатель : отношение продолжительности времени, которой соответствует «плечо» на кривой отмирания клеток облученной популяции к аналогичному временному промежутку для интактных клеток. Введен также показатель приращения времени (t0), необходимого для снижения количества живых клеток в популяции в «е» раз, где е – основание натуральных логарифмов. Этот показатель для кривых отмирания отражает наклон линейной части графиков зависимости выживаемости от времени выдерживания клеток в непитательной среде. Способ расчета критерия k и показателя t0 отражен на рис. 1.

О благоприятном воздействии ионизирующего излучения на выживаемость клеток облученной популяции по сравнению с необлученным контролем свидетельствуют повышенные показатели (> 1,0), t0обл. (по сравнению с соответствующим t0-контр.) и критерий k (> 1,0). Указанные параметры кривых отмирания, полученные в трех основных сериях экспериментов для штаммов дикого типа (Т1 и XS800) и мутанта (Т4), сведены в таблице.

Таблица. Зависимость кинетики отмирания клеток Saccharomyces cerevisiae от генотипа, дозы облучения и температуры последующего инкубирования в непитательной среде Т1 (дикий тип) XS800 (дикий тип) Т4 (рад. мутант) Штамм 1 2 3 4 5 6 7 8 доза, Гр 130 670 1200 580 580 580 50 50 выживае- 75,0 20,1 5,2 15,1 15,1 15,1 20,0 20,0 20,мость, % ± 5,2 ± 4,3 ± 1,9 ± 1,6 ± 1,6 ± 1,6 ± 5,0 ± 5,0 ± 5,температу37 37 37 30 37 40 30 37 ра, оС 3,0 2,0 2,0 1,0 2,0 1,0 2, - - ± 0,4 ± 0,2 ± 0,4 ± 0,2 ± 0,2 ± 0,3 ± 0,t0-контр., 9,0 2,7 3,5 3,3 3,0 1,5 3,0 3,1 1,сут. ± 1,0 ± 0,5 ± 0,6 ± 0,4 ± 0,4 ± 0,4 ± 0,6 ± 0,4 ± 0,12,5 4,3 8,5 8,5 4,0 2,8 7,7 4,6 2,t0-обл., сут.

± 1,0 ± 0,3 ± 1,0 ± 1,5 ± 0,3 ± 0,3 ± 0,5 ± 0,3 ± 0,1,9 1,7 2,1 1,7 1,6 1,4 1,6 1,5 1,k ± 0,2 ± 0,3 ± 0,3 ± 0,3 ± 0,2 ± 0,4 ± 0,1 ± 0,2 ± 0,Из приведенных данных видно, что эффект радиационного гормезиса по критерию снижения скорости отмирания клеток в популяции характерен не только для диких штаммов, для которых существуют механизмы пострадиационной репарации повреждений ДНК, но и для мутантного штамма, возможности восстановления которого после воздействия ионизирующего излучения ограничены. Параметры кривых отмирания клеток при одинаковых условиях для всех трех штаммов совпадают в пределах статистической вариабельности (как, например, в столбцах 2, 5 и 8). Это свидетельствует о возможном участии немишенных событий в проявлении гормезиса, если рассматривать молекулу ДНК как основную мишень для квантов.

При изучении зависимости динамики отмирания клеток от дозы (столбцы 1 – 3), было отмечено замедление процессов отмирания выживших клеток даже в случае облучения в дозе, вызывающей гибель большей части клеточной популяции. При отсутствии закономерного изменения параметра k с дозой, с увеличением дозы угол расхождения кривых отмирания облученных и интактных клеток даже несколько возрастал. Это свидетельствует о некотором снижении чувствительности к факторам, вызывающим старение и отмирание, у клеток, переживших не только малую, но и высокую дозу облучения, и о переходе выжившей фракции клеток в новое, стабильное состояние.

При воздействии на клетки острого облучения в разных дозах и дополнительного экологического фактора – повышенной температуры было выявлено (столбцы 4 – 9), что клетки, инкубированные после предварительного облучения при температурах 30, 37 и 40 оС, в целом демонстрируют более медленный темп отмирания, чем контроль. Коэффициент замедления отмирания для уровня выживаемости 10% при всех изменениях температуры остается достаточно стабильным в пределах статистической вариабельности, отражая слабую зависимость динамики отмирания облученных клеток от температуры инкубирования.

При исследовании влияния длительного хронического облучения на популяции дрожжевых клеток было выявлено, что отмирание клеток в условиях 30-кратного снижения радиационного фона происходит до значительно меньшего уровня выживаемости, чем при фоновом или даже при повышенном уровне радиации (это видно на рис. 2). Данный факт указывает на важность непрерывного хронического воздействия естественного радиационного фона Земли как экологического фактора для поддержания процессов нормальной жизнедеятельности организмов.

Рис. 2. Кривая зависимости выживаемости диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae XS1898, инкубированных в непитательной 0,10-2 10-1 100 101 102 103 Радиационный фон Выживаемость, % среде при температуре 30 оС в течение одного месяца, от мощности дозы хронического облучения, нормированной к интенсивности редкоионизирующего компонента естественного радиационного фона (10-7 Гр/ч) Из литературы известно (Булдаков, Калистратова, 2003; Luckey, 1991), что острые дозы, влияющие на увеличение средней продолжительности жизни, лежат в том же диапазоне, что и дозы, вызывающие адаптивный ответ на последующее облучение. Как показано в настоящем исследовании, эта закономерность может быть выявлена и для дрожжевых клеток.

Проявление адаптивной реакции делящихся дрожжевых клеток В сериях экспериментов были изучены закономерности зависимости величины адаптивного ответа от дозы, мощности дозы, продолжительности облучения, длительности интервала между адаптирующим и поражающим облучением для клеток популяций Saccharomyces cerevisiae дикого диплоидного штамма XS800, находящихся в жидкой питательной среде в логарифмической фазе роста.

Влияние мощности дозы пролонгированного адаптирующего облучения на последующий адаптивный ответ в широком диапазоне мощностей доз – от 10-5 до 70 Гр/ч – исследовано впервые.

На рис. 3 представлены типичные для данной серии опытов кривые выживаемости интактных и адаптированных с мощностями доз 10-4 и 10 Гр/ч клеток при повторном воздействии -излучения в тестирующих острых дозах от 80 до 1400 Гр. Показан расчет основного параметра – фактора изменения дозы (ФИД) – это отношение равноэффективных доз тестирующего облучения для адаптированной и контрольной популяций клеток, например, для уровня выживаемости 10 %.

10-4 Гр/ч 10 Гр/ч 10 ФИД=1,ФИД=2,1 A Б 0,0,0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 1200 Доза острого облучения, Гр Доза острого облучения, Гр Рис. 3. Адаптивная реакция адаптированных в течение 24 ч диплоидных дрожжевых клеток () штамма XS800 в логарифмической фазе роста по сравнению с контролем (). А – мощность дозы предварительного облучения 10-4 Гр/ч; Б – мощность дозы 10 Гр/ч Начиная с мощности дозы 10-4 Гр/ч, являющейся пороговой для проявления эффекта, величина адаптивного ответа, оцениваемая по параметру ФИД, растет до некоторого предела мощности адаптирующей дозы, находящегося в области около 10 Гр/ч. Далее с увеличением мощности дозы наблюдается снижение показателя ФИД для адаптированной и контрольной клеточных популяций. Общий характер изменения параметра ФИД в связи с увеличением мощности дозы адаптирующего излучения отражен на рис. 4.

Мощность дозы 10 Гр/ч не является критической для роста популяции, она не останавливает его, но в значительной степени тормозит. В представляемой диссертационной работе впервые показана возможность проявления адаптивной реакции у клеток после предварительного облучения с высокими мощностями доз, вызывающего значительное снижение скорости размножения облученной клеточной популяции или даже преобладание гибели клеток над размножением при длительном культивировании популяции в жидкой питательной среде.

Рис. 4. Зависимость фактора изменения до- зы (ФИД) от мощности дозы 24-часового адаптирующего воздействия при адаптивном ответе облученных клеток штамма XS в логарифмической фазе роста по сравне- нию с контролем Сходный тип проявления закономерностей адаптивной реакции был обнаружен и при предварительном действии острого облучения в качестве адаптирующего. Был исследован широкий диапазон предварительных доз – от 10-2 до 103 Гр. Фрагменты результатов серии экспериментов, отражающих закономерно10-7и10-6 10-5 10-4 10-3 ад пти100 101 ст проявления 10-2а10-1 вной реакции дрожжевыми клетками в диапазоне адаптирующих доз 1 сГр – Мощность адаптирующей дозы, Гр/ч Гр, представлены на рис. 5. На основании полученных данных построены пары кривых «доза – эффект», для каждой из которых сопоставлены уровни равноэффективных доз и рассчитаны ФИД10%.

Выживаемость, % Выживаемость, % 10% ФИД 100 0,1 Гр 80 Гр 10 ФИД=1,ФИД=3,Б А 0,0,0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Доза повторного острого облучения, Доза повторного острого облучения Рис. 5. Адаптивная реакция клеток штамма XS800 в логарифмической фазе роста, облученных в острых адаптирующих дозах (), по сравнению с неадаптированным контролем (). Продолжительность между облучениями – 4 ч, t=30 оС. Величины адаптирующих доз для А – 0,1 Гр (пороговая доза), для Б – 80 Гр (доза, инициирующая максимальное проявление адаптивного ответа) В серии экспериментов по изучению острого адаптирующего воздействия -излучения на клетки Saccharomyces cerevisiae было выявлено, что пороговая доза для острого адаптирующего облучения составляет около 10 сГр, для области доз 50 – 160 Гр существует экстремум в проявлении адаптивной реакции, а после увеличения адаптирующей дозы выше 800 Гр адаптивный ответ клеток популяции невозможен.

Получены данные о зависимости величины адаптивного ответа делящихся клеток XS800 от длительности промежутка между острыми облучениями – адаптирующим и тестирующим. Результаты исследования отражены на диаграмме на рис. 6. Показано, что существует оптимальный для формирования адаптивного ответа промежуток времени, после которого наблюдается снижение резистентности клеток к последующему облучению. Этот результат также важен для экологии, свидетельствуя о большей эффективности хронического воздействия фактора для проявления эффекта по сравнению с острым его приложением.

Рис. 6. Зависимость выживаемости клеток штам- ма XS800 в логарифмической фазе роста, остро облученных в адаптирующей дозе 80 Гр и облу- ченных в последующей тестирующей дозе 500 Гр (столбцы 1-6, 24), от продолжительности времени между облучениями.

Столбец «К»–выживаемость контроля, однократ- но облученного в дозе 500 Гр.

К 1 2 3 4 5 0 2 4 6 Время, ч 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 Время, сутки Время, сутки Рис. 7. Зависимость количества (%) макроколоний, образованных облученными дрожжевыми клетками штамма XS800, от продолжительности их роста на твердой питательной среде. А. Клетки, находящиеся в логарифмической стадии роста, предварительно облучены в адаптирующей дозе в течение 24 часов при мощности дозы 7 Гр/ч ; последующая тестирующая доза составляла 2200 Гр (). Контрольная популяция дрожжевых клеток не подвергалась предварительному хроническому облучению ().

Б. Клетки, находящиеся в логарифмической стадии роста, облучены только в тестирующей дозе 1200 Гр (), а также в этой же тестирующей дозе после предварительного острого облучения клеток в адаптирующих дозах 80 Гр () и 160 Гр ().

Обнаружен эффект ускорения деления клеток и формирования макроколоний при высеве на плотную питательную среду у предварительно адаптированных клеток после тестирующего облучения по сравнению с клетками, облученными только в тестирующей дозе. Данную закономерность наблюдали как после хронического облучения в адаптирующей дозе (это отражено на рис. 7. А), так и после предварительного острого воздействия на клетки -излучения (что видно на рис. 7. Б). Возможно, данный эффект можно объяснить феноменом стимуляции клеток к делению под воздействием ионизирующего излучения.

Таким образом, в работе количественно описаны эффект проявления замедления скорости гибели клеток в облученных популяциях дрожжей и реакция адаптивного ответа предварительно облученных клеток на последующее облучение.

Выживаемость, % Выживаемость, % Выживаемость после повторного облучения, % Количество Количество выросших макроколоний, % выросших макроколоний, % ВЫВОДЫ 1. Получены экспериментальные данные, демонстрирующие эффект радиационного гормезиса на популяциях дрожжевых клетках различного генотипа. Этот эффект проявлялся в замедлении отмирания выживших после облучения клеток по сравнению с интактными клетками. Впервые показано, что гормезисные эффекты могут быть выявлены не только в области малых доз, как это традиционно предполагается, но и после больших доз ионизирующего излучения, когда доля погибших клеток составляет 80-95%.

Этот факт имеет большое значение для проблем экологии, указывая на возможные механизмы восстановления природных популяций микроорганизмов после поражающего действия ионизирующего излучения.

2. Для количественного описания эффекта гормезиса введен коэффициент замедления отмирания клеток, определяемый отношением продолжительностей отмирания облученных и контрольных клеток и рассчитанный для некоторого изоэффективного уровня. В соответствии с этим параметром, выжившие после облучения клетки, отмирали почти в 2 раза медленнее контрольных (1,9 ± 0,2). В исследованном диапазоне доз (13 – 1200 Гр) этот параметр не зависел от дозы, в которой были облучены популяции клеток, а также от температуры (30-40 °С) пострадиационного культивирования клеток.

3. Показана возможность замедления скорости гибели в популяциях облученных клеток диких штаммов и штаммов, частично дефектных по способности репарировать радиационные повреждения ДНК. Поскольку традиционно молекула ДНК рассматривается в качестве одной из главных мишеней в клетке, поглощение энергии в которой приводит к регистрируемым радиационным эффектам, полученные нами данные свидетельствует о возможном участии немишенных событий в проявлении гормезиса.

Pages:     ||
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.