WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     |
|

На правах рукописи

ГОРШКОВА Татьяна Александровна КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ И РАДИАЦИОННОГО ГОРМЕЗИСА У ПОПУЛЯЦИЙ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК 03.00.01 – радиобиология и 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск – 2007 Диссертация выполнена в биофизической лаборатории Отдела исследования комбинированных воздействий ГУ «Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук» Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич;

кандидат биологических наук Комарова Людмила Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Борейко Алла Владимировна доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 24 апреля 2007 г. в 11.00 час.

на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при ГУ «Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук» по адресу: 249036, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Королёва, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ–МРНЦ РАМН

Автореферат разослан 21 марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В современной радиобиологии и радиоэкологии наиболее актуальным направлением в настоящее время является изучение эффектов малых доз. Это определяется расширением сфер использования ионизирующих излучений в промышленности и медицине и, следовательно, связано с необходимостью реальных оценок последствий радиационных аварий для больших когорт населения, а также для природных сообществ значительных регионов планеты. Проблема малых доз атомной радиации возникает при экстремальных ситуациях, приводящих к радиоактивному загрязнению больших территорий, также она является актуальной для рабочих урановых рудников, предприятий по переработке урановых руд, получению вторичного ядерного горючего, отработке отходов АЭС. В связи с этим закономерности действия ионизирующего излучения как природного, так и антропогенного экологического фактора, на биологические объекты требуют детального изучения на всех уровнях организации биологических систем. Многочисленные накопленные в литературе факты о биологическом воздействии ионизирующей радиации в малых дозах свидетельствуют как о позитивном (Кузин, 1995), так и о негативном их влиянии на ранние и отдаленные эффекты у облученных клеток, организмов, популяций, сообществ (Зайнуллин, Таскаев, 2005). До настоящего времени отсутствует целостное представление о механизмах, формирующих эффекты малых доз (Эйдус, 1996; Боднарчук, 2002). Спектр реакций на облучения у многоклеточных организмов во многом определяется индивидуальными особенностями функционирования их иммунной и других надклеточных систем (Liu, 2003), тогда как изучение данной проблемы на одноклеточных организмах, к которым относятся использованные в настоящей диссертационной работе дрожжи Saccharomyces cerevisiae, позволяет вычленить закономерности и механизмы действия малых доз облучения, проявляющиеся на клеточном и популяционном уровнях. Для одноклеточных организмов, менее радиочувствительных чем многоклеточные, эволюционировавших в условиях на порядки менявшегося радиационного фона, мало изучены диапазоны доз и мощностей доз, вызывающих эффекты гормезисного увеличения сроков жизни клеток и их адаптивной реакции на последующее облучение. В связи с этим актуальной представляется также оценка вклада генотипа клеток в характер их реакции на облучение, изучение особенностей динамики гибели и размножения клеток, подвергшихся облучению, исследование совместного действия на клетки ионизирующей радиации и другого экологического фактора – температуры, определение роли радиорезистентности отдельных клеток в устойчивости к облучению клеточной популяции в целом.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является выявление количественных закономерностей формирования эффектов радиационного гормезиса и адаптивного ответа у дрожжевых клеток под действием острого и пролонгированного облучения.

Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

1–изучить закономерности динамики отмирания дрожжевых клеток после однократного острого облучения в малых и больших дозах;

2–исследовать зависимость изменения динамики отмирания клеток в облученных и контрольных популяциях от дозы облучения и температуры инкубирования;

3–оценить зависимость отмирания клеток после облучения от их способности репарировать радиационные повреждения ДНК;

4–установить зависимость степени проявления адаптивной реакции популяции клеток в логарифмической фазе развития от мощности дозы предварительного пролонгированного облучения и от величины дозы острого адаптирующего воздействия;

5–выявить величины диапазонов доз и мощностей доз предварительного облучения, вызывающих последующий адаптивный ответ у Saccharomyces cerevisiae, 6–выяснить зависимость величины адаптивного ответа от временнго интервала между облучениями в адаптирующей и тестирующей дозах;

7–подтвердить важность непрерывного хронического воздействия естественного радиационного фона как экологического фактора в экспериментах по отмиранию дрожжевых клеток при снижении интенсивности фонового излучения.

Научная новизна работы.

– Впервые получены данные о замедлении скорости отмирания клеток Saccharomyces cerevisiae, остро и пролонгированно облученных в различных дозах, в том числе вызывающих гибель значительной части клеток популяции, и инкубированных в непитательной среде;

– показаны увеличение скорости гибели клеток Saccharomyces cerevisiae при 30-кратном снижении радиационного фона и замедление отмирания клеток в популяции при хроническом воздействии ионизирующей радиации с мощностями доз, на порядки превосходящими фоновые значения;

– проведено сравнительное изучение влияния генотипических особенностей дрожжевых клеток разных штаммов, инкубированных при различных температурах, на изменение сроков их гибели после воздействия облучения. Отмечено возможное участие немишенных, не связанных с повреждением молекулы ДНК событий в проявлении гормезисного замедления отмирания клеток;

– установлены границы диапазона доз и мощностей доз, вызывающих адаптивный ответ дрожжевых клеток на последующее облучение. Обнаружено существование адаптивной реакции у клеток, выживших после предварительного облучения как в малых, так и в высоких дозах, вызывающих гибель значительной части популяции.

Практическая значимость. Полученные экспериментальные данные могут иметь практическую значимость для прикладной радиобиологии, радиоэкологии, медицинской радиологии, а также для прогнозирования отдаленных последствий облучения. Обнаруженные и описанные в данной работе эффекты могут иметь значение для разработки математических моделей динамики развития популяций организмов, отличающихся высокой радиорезистентностью, в ответ на действие природных или вызванных антропогенно повышенных уровней радиации. Результаты работы имеют также фундаментальное значение, дополняя современный уровень представлений об особенностях и вероятных механизмах таких эффектов малых доз, как гормезисное увеличение средней продолжительности жизни и адаптивный ответ.

Структура и объем диссертации.

Работа изложена на 154 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей результаты экспериментальных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов и списка литературы, содержащего 228 источников, из которых 90 опубликованы на русском языке и 138 – на английском. Результаты работы иллюстрированы 8 таблицами и 34 рисунками.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на III Международной научно-практической конференции «Медико-дозиметрические регистры – основа регламентации радиационной безопасности профессионалов и населения» (Омск, 2004), XL научных чтениях памяти К.Э.Циолковского (Калуга, 2005), V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), IX Российской научной конференции «Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях» (Обнинск, 2006).

Диссертация апробирована на заседании кафедры биологии Обнинского Государственного Технического Университета Атомной Энергетики (ИАТЭ) 13 декабря 2006 г. и на межлабораторной научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН 21 декабря 2006 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

– проявление радиационного гормезиса по критерию уменьшения скорости отмирания клеток в популяциях после облучения в малых и больших дозах ионизирующего излучения у дрожжей различных генотипов, инкубированных при нескольких температурах;

– зависимость выраженности адаптивного ответа облученных популяций дрожжевых клеток от величины, мощности адаптирующей дозы, временнго интервала между облучениями;

– возможность проявления адаптивного ответа клетками, облученными в высоких дозах или с высокими мощностями доз, вызывающими остановку размножения и гибель части клеток популяции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. В данной работе были использованы следующие штаммы Saccharomyces cerevisiae: диплоидный штамм дикого типа Т1 (RAD/RAD), радиочувствительный мутант Т4 (rad2/radrad54/rad54), дикий диплоидный штамм XS800 (RAD/RAD) и мутантный по репарации радиационных повреждений штамм XS1898 (rad52-1/rad52-1). В качестве биологического теста была выбрана выживаемость, определяемая по способности клеток образовывать макроколонии при 30 оС на плотной питательной среде в чашках Петри.

Источники ионизирующего излучения и условия облучения. В работе использовали -излучение изотопов 60Со (установки «Исследователь» с мощностью дозы порядка 3300 Гр/ч, «Луч» с мощностью дозы от 10-2 до 70 Гр/ч, «Фотон» с мощностью дозы 10-6 – 10-5 Гр/ч) и 137Cs (установка «Панорама» с мощностью дозы 10-4 – 10-2 Гр/ч). Варьирьвание мощности дозы на установках «Луч», «Панорама», «Фотон» осуществляли изменением расстояния от источника. На установке «Исследователь» давали только острые дозы свыше 20 Гр. Острое облучение производили при комнатной температуре, время острого воздействия составляло от нескольких секунд до 25 мин. Пролонгированное воздействие ионизирующего облучения, продолжительность которого в зависимости от условий опыта варьировало от 2,5 - 24 ч до 30 сут., осуществляли с использованием суховоздушного термостата с температурой 30 оС. Контрольные суспензии во время облучения подопытных образцов находились в аналогичных температурных условиях при фоновых значениях ионизирующей радиации, составлявших в среднем около 10-7 Гр/ч. В опыте по изучению влияния пониженного радиационного фона на отмирание клеток использовали специальную низкофоновую камеру, изготовленную из свинца, выплавленного до начала эпохи ядерных испытаний. Камера, вмещавшая пробы, помещенные в термостат с температурой 30 оС, обеспечивала снижение мощности дозы редкоионизирующего компонента естественного радиационного фона до 0,3·10-8 Гр/ч.

Методика и условия экспериментов. В многодневных опытах по изучению старения и отмирания дрожжевых клеток использовали клеточные суспензии на основе дистиллированной воды с начальной концентрацией клеток порядка 106 клеток/мл, которую определяли при помощи камеры Горяева. После острого облучения, термостатирования при t=30, 37 и 40 оС, либо хронического облучения при температуре 30 оС осуществляли разведение суспензий и посев клеток в чашки Петри на поверхность плотной питательной среды. В опытах по исследованию действия 24-часового адаптирующего облучения на популяции клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, использовали клеточные суспензии в жидкой питательной среде состава: 2 % глюкозы, 0,2 % дрожжевого экстракта, 1 % пептона, 96,8 % дист. воды. Начальная концентрация клеток, подобранная с использованием камеры Горяева, составляла 102 – клеток/мл в зависимости от условий облучения, определявших степень размножения и гибели клеток.

После прекращения пролонгированного облучения концентрации размножившихся клеток составляли – 107 клеток/мл суспензии. Для последующего острого облучения концентрацию клеток в пробах по необходимости доводили до уровня 106 клеток/мл, разбавляя суспензию достаточным количеством свежей жидкой питательной среды. После облучений и соответствующих разведений в дистиллированной воде клетки высевали в чашки Петри на поверхность плотной питательной среды. В экспериментах с острым и 2,5 – 5-часовым пролонгированным адаптирующим воздействием ионизирующего излучения на растущие популяции Saccharomyces cerevisiae клетки культивировали в течение 7 – 8 ч при температуре 30 оС для достижения ими середины логарифмической фазы. Концентрация клеток в питательной среде составляла не больше 106 клеток/мл суспензии. Клетки облучали адаптирующими дозами и помещали на восстановление в термостат с температурой 30 оС. Спустя 1 – 24 ч концентрации размножившихся в жидкой питательной среде клеток приводили к уровню 106 клеток/мл и облучали тестирующими острыми дозами. Учет выживаемости клеток осуществляли по описанному выше методу макроколоний.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Закономерности замедления отмирания облученных дрожжевых клеток Эксперименты проводили на клетках диких и мутантных по способности к репарации штаммов, выдерживаемых после облучения в дистиллированной воде при температурах 30, 37 и 40 оС.

На рис. 1 представлены кривые отмирания облученных и интактных клеток дикого штамма Т1 в непитательной среде. Из рис. 1.А видно, что острое облучение дрожжей в дозе, снижающей выживаемость клеток до 75 %, приводило к значительному замедлению скорости отмирания выживших после облучения клеток по сравнению с необлученным контролем. Это видно как по увеличению «плеча» на кривых отмирания, т. е. продолжительности накопления субповреждений, неэффективных для гибели большей части клеток популяции, так и с уменьшением наклона экспоненциальных участков этих кривых. На рис. 1.Б выживаемость клеток, переживших облучение, нормирована к 100 %. При такой форме сопоставления кривых выживаемости становится возможным анализ эффективности воздействия ионизирующего излучения для гормезисного увеличения сроков жизни клеток облученной популяции.

Pages:     |
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.