WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Ранее в работах нашей лаборатории было показано, что патогенный оомицет Phytophtora infestans (Mont.) de Bary при выращивании на среде, содержащей белки из клубней картофеля, продуцирует комплекс сериновых протеиназ с субтилизиноподобной активностью [Гвоздева и др., 2004]. Кроме того, было установлено, что в клубнях картофеля в ответ на поражение P. infestans накапливались белки с м. м. около 20-24 кДа [Valueva et al., 1998; Валуева и др., 2003]. Можно предположить, что белки, кодируемые генами PKPI-C, принимают активное участие в защите картофеля от патогена.

Рис. 5. Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка PKPI-С2 (А) и выделенного из клубней белка PKSI (В) и их влияние на активность субтилизина Карлсберг (Б и Г, соответственно).

A: 1 – белки-маркеры, 2 – белки, не связавшиеся с Ni-NTA-агарозой, после нанесения на колонку растворимой клеточной фракции Е. coli, 3 – элюат, содержащий рекомбинантный белок PKPI-С2. Б: влияние на активность субтилизина белка PKPI-C2.

В: 1 – белки-маркеры, 2 – белок PKSI. Г: влияние на активность субтилизина белка PKSI.

В качестве субстрата для определения ферментативной активности использовали Z-AlaAla-Leu-pNa.

4.3. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белков, кодируемых генами Spls-KPI-B из S. brevidens Для проведения гетерологичной экспрессии белков Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, SplsKPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемых соответствующими генами из S.

brevidens, были созданы экспрессионные плазмиды на основе вектора pQE30.

Использованные для этой цели клоны двух генов Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-Bсодержали несинонимичные замены по сравнению с последовательностями оригинальных генов. В результате рекомбинантный белок Spls-KPI-B1 содержал одну замену Thr13Ala13, а белок Spls-KPI-B3 — две замены: Ser4Gly4 и Lys133Arg133.

Аминокислотные последовательности белков Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-Bполностью соответствовали белкам, кодируемым оригинальными генами.

После экспрессии в клетки E. coli белковые продукты с м.м. около 26 кДа, отсутствовавшие у контрольных бактерий, трансформированных вектором pQE30, не содержащим вставки, были обнаружены и в растворимой фракции клеточных белков, и в тельцах включения. Очистку белков растворимой фракции, проводили методом металлохелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Полученные белки анализировали DS-Na-ПААГ-электрофорезом (рис. 6). Как видно на рис. 6А в препаратах Spls-KPI-B1 (2) и Spls-KPI-B4 (5) наряду с целевыми белками присутствовали примеси, поэтому они были дополнительно очищены методом анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гомогенность белков Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 была подтверждена DS-Na-ПААГ-электрофорезом (рис. 6Б).

Рис. 6. Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантных белков Spls-KPI-B после очистки на колонке с Ni-NTA-агарозой (А) и белков Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 после анионообменной хроматографии (Б).

А: 1 – белки-маркеры; 2 - Spls-KPI-B1; 3 - Spls-KPI-B2; 4 - Spls-KPI-B3; 5 - Spls-KPI-B4; - Spls-KPI-BБ: 1 – белки-маркеры; 2 - Spls-KPI-B1; 3 - Spls-KPI-BАктивность рекомбинантных белков Spls-KPI-B оценивали по степени подавления активности трипсина, химотрипсина, HLE и папаина. Было установлено, что все пять белков не действовали на HLE и папаин, хотя с разной степенью эффективности ингибировали трипсин (таблица). Два из пяти рекомбинантных белков, Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4, эффективно подавляли и активность химотрипсина. При эквимолярном соотношении фермент:ингибитор достигалось подавление 50% активности фермента (рис. 7).

Таблица. Ингибирование трипсина белками Spls-KPI-B Белок Концентрация BANA, мМ Ki (нМ) Spls-KPI-B1 0,125 0,25 345,Spls-KPI-B2 0,125 0,25 1310,Spls-KPI-B3 0,125 0,25 Spls-KPI-B4 0,125 0,25 84,Spls-KPI-B5 0,125 0,25 3883,Рис. 7. Влияние белков Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 на активность химотрипсина 1 – Spls-KPI-B1, 2 – Spls-KPI-B4. В качестве субстратов для определения ферментативной активности использовали N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa.

Сравнение аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков и известных поданным литературы белков PKPI, для которых установлены как аминокислотные последовательности, так и их действие на сериновые протеиназы приведено на (рис. 8). Все представленные белки способны подавлять активность трипсина, но различаются по способности действовать на химотрипсин.

Белки PKPI являются так называемыми «каноническими» ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на поверхности специфическую структуру – «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь P1-P1', образующая реактивный центр ингибитора. Действительно, как видно из данных представленных на рис. 8, в аминокислотных последовательностях всех ингибиторов PKPI-B присутствует консервативный участок, окружающий пептидную связь Arg68-Phe69, который заключен в пептидную петлю, образованную остатками Cys49-Cys98. Этот участок молекулы ингибитора представляет собой первый реактивный центр и ответственен за связывание трипсина. Тем не менее, следует обратить внимание на то, что белок Spls-KPI-B2 оказался способен связываться с трипсином (табл.), несмотря на то, что в положении P1 остаток Arg68 замещен на Ser68.

Кроме того, в этом белке присутствует замена аминокислотного остатка в положении P3’ и значительная делеция, которая могла бы вызывать нарушение структуры петли связывания. Можно предположить, что ингибирование трипсина белками PKPI может протекать и по другому не субстратоподобному механизму.

В опубликованной ранее работе [Valueva et al., 2000] было сделано заключение, что в молекуле двухцепочечного белка PSPI-21-6.3 пептидная связь между аминокислотными остатками Met116-Leu117 входит в состав второго реактивного центра, ответственного за связывание химотрипсина. Было предположено, что дисульфидная связь между остатками Cys147-Cys164, соединяющая А- и Б-цепи PSPI21-6.3, формирует «каноническую» петлю связывания, в которой располагается пептидная связь реактивного центра связывания химотрипсина (HLE), Met116-Leu117.

В то же время у белков Spls-KPI-B2 и Spls-KPI-B3, в структуре которых «каноническая петля» могла бы сформироваться между остатками Cys147 и Cys164 и содержать второй потенциальный реактивный центр связывания химотрипсина, в положении P1–P1' которого локализованы остатки Met153-Thr154, не было обнаружено антихимотрипсиновой активности. В отличие от них белок P1H5, обладающий такими же структурными особенностями, действует как эффективный ингибитор химотрипсина.

Белок Spls-KPI-B5, аминокислотная последовательность которого, за исключением N-концевых областей, кодируемых последовательностями нуклеотидов, представляющих фрагменты экспрессионных векторов pET23 и pQE30, совпадает с последовательностью рекомбинантного белка PKPI-B10, также не проявлял способности действовать на химотрипсин. В то время как белок PKPI-B10 был способен нестехиометрически взаимодействовать с этим ферментом. Можно предположить, что белки PKPI-B способны слабо нестехиометрически связывать химотрипсин и по трипсинсвязывающему реактивному центру. Возможность такого рода взаимодействия с протеиназой может легко устраняться либо за счет модификации структуры участков молекулы, не связанных прямо с реактивным центром (как в случае с Spls-KPI-B3 и Spls-KPI-B5), либо за счет мутаций в реактивном центре (замена Arg68-Ser68 в Spls-KPI-B2).

Наличие антихимотрипсиновой активности у белка Spls-KPI-B4, в структуре которого в положении P1 предполагаемого второго реактивного центра связывания фермента остаток Met153 заменен на Val153, и отсутствие такой активности у белков Spls-KPI-B2 и Spls-KPI-B3, в структуре которых в P1–P1' положении локализованы остатки Met153-Thr154, свидетельствует о том, что этот остаток не может быть локализован в реактивном центре и участвовать во взаимодействии белков PKPI с химотрипсином.

Рис. 8. Сравнение полных аминокислотных последовательностей зрелых белков PKPI-B-ингибиторов трипсина и химотрипсина PKPI-B10, Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4, Spls-KPI-B5 [в настоящей работе]; PSPI-21-6.3. [Valueva et al., 2000]; P1D4, P1H5, P4B1 [Heibges et al., 2003].

Различающиеся аминокислотные остатки окрашены серым цветом различной интенсивности. Реакционные центры обозначены стрелками. Остатки Cys выделены черным цветом. Дисульфидные связи (Cys49-Cys98 и Cys147- Cys164) обозначены * и **, соответственно.

Синим шрифтом показаны последовательности тех белков, которые действуют как ингибиторы химотрипсина. Зеленым цветом обозначена последовательность, кодируемая в белке PKPI-B10 фрагментом полилинкера pET23а. Красным цветом – последовательность, кодируемая в белке Spls-KPI-B5 фрагментом полилинкера pQE30.

Оранжевым — последовательность глутатион-S-трансферазного тага (GST) в белках P1D4, P1H5 и P4B1. Последовательность полигистидинового тага (6хHis) подчеркнута одиночной линией; праймера PKPI-B1 - двойной.

ВЫВОДЫ:

1. Установлены последовательности 16 генов PKPI, кодирующих в геноме картофеля сорта Истринский ингибиторы протеиназ типа Кунитца. Из них 6 генов кодируют белки PKPI-А, 4 – PKPI-В и 6 – PKPI-С. Частично определены последовательности еще двух генов, кодирующих белки PKPI-С.

2. Установлены последовательности 11 генов Spls-KPI, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме неклубненосного картофеля (Solanum brevidens Phill.), из них 6 — кодируют белки группы А и 5 — белки группы В. Показано значительное сходство некоторых генов Spls-KPI из S. brevidens и PKPI групп А и В из различных сортов картофеля.

3. Получен рекомбинантный белок PKPI-B10, кодируемый геном PKPI-B10 из генома картофеля сорта Истринский. Показано, что белок PKPI-B10 эффективно подавляет активность трипсина и значительно слабее химотрипсина, но не действует на эластазу из лейкоцитов человека, субтилизин Карлсберг, протеиназу К и папаин. Белок PKPI-10 подавлял также рост и развитие фитопатогенноого гриба Fusarium culmorum.

4. Получен рекомбинантный белок PKPI-С2, кодируемый геном PKPI-C2 из генома картофеля сорта Истринский. Установлено, что белок PKPI-С2 является специфическим ингибитором субтилизина Карлсберг. Белок не действует на трипсин, химотрипсин и папаин.

5. Получены рекомбинантные белки Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, SplsKPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами из генома S. brevidens.

Показано, что все рекомбинантные белки с разной степенью эффективности ингибировали трипсин и не действовали на эластазу из лейкоцитов человека и папаин.

Два из них — Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 — подавляли активность химотрипсина.

6. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI содержат мозаично расположенные блоки. Полученные данные позволяют предположить, что в процессе эволюции вследствие рекомбинации кодирующие области генов PKPI растений семейства пасленовых (Solanaceae) подвергаются перестройкам, что приводит к вариабельности их структуры и, как следствие, к изменению функции кодируемых белков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Сперанская А.С., Дорохин А.В., Новикова С.И., Шевелев А.Б., Валуева Т.А.

Клонирование последовательности, кодирующей ингибитор SKTI из картофеля // Генетика. 2003. Т. 39. № 10. С. 1490–1497.

2. Ревина Т.А., Сперанская А.С., Кладницкая Г.В., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Белокингибитор субтилизина из клубней картофеля // Биохимия. 2004. Т. 69 № 10. С. 13451352.

3. Сперанская А.С., Криницына А.А., Полтрониери П., Фазано П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца группы В из картофеля: молекулярное клонирование генов // Биохимия. 2005. Т. 70. № 3. С. 360369.

4. Сперанская А.С., Криницына А.А., Ревина Т.А., Герасимова Н.Г., Керученько Я.С., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гетерологичная экспрессия, очистка и свойства белкаингибитора сериновых протеиназ из картофеля. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 11. С.

1451-1458.

5. Speransky A.S., Cimaglia F., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Fasano P., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Halterman D., Shevelev A.B., Santino A. Kunitz-type protease inhibitors group B from Solanum palustre // Biotechnol. J. 2007 V. 2. № 11. P. 1417-1424.

6. Валуева Т.А., Сперанская А.С., Ревина Т.А., Шевелев А.Б. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 344-359.

7. Сперанская А.С., Дорохин А.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / III Международная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Республика Беларусь. Минск. 2003.С. 8. Сперанская А.С., Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / Тез. XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2004. С. 41.

9. Сперанская А.С., Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Три группы генов, кодирующих ингибиторы протеиназ Кунитца из картофеля S. tuberosum / Материалы международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология".

Республика Беларусь. Минск. 2004. С. 347-348.

10. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Fasano P., Poltronieri P., Valueva T.A., Shevelev A.B., Santino A. Class A Kunitz-type proteinase inhibitor genes polymorphism in Solanum genus / SISV-SIGA joint congress. Italy. Lecce. 2004. Р. 71-72.

11. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Santino A., Protzenko M.A., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Shevelev A.B. Cloning of the Genes encoding for class A and class B Kunitz-type proteinase inhibitor (PKPI) in S. tuberosum cv. Istrinskii, and comparison with related genes cloned in S. brevidens, S. stoloniferum and S. andigenum / 1'st Solanaceae Genome Workshop. Netherlands. Wageningen. 2004. Р. 93.

12. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Revina T.A., Poltronieri P., Santino A., Shevelev A.B., Valueva T.A. Cloning the genes encoding for Kunitz-type proteinase inhibitors group C from potato. // FEBS Journal. 2005 V. 272. S. 1. P. 176-13. Сперанская А.С., Криницына А.А., Стеганова О.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А.

Гены ингибитора протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 248-253.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»