WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Эти данные позволили заключить, что наличие в структуре белка PSPI-21-6.3 двух полипептидных цепей является результатом посттрансляционного протеолиза по пептидным связям Ser178-Thr179 и Phe184–Ser185.

Сравнение последовательностей выделенных нами генов и других PKPI, представленных в базе данных NCBI, показало, что большинство генов группы А и все гены группы В из картофеля сорта Истринский либо полностью совпадали с генами из других сортов картофеля (PKPI-А1, PKPI-А3, PKPI-А4, PKPI-А6 и PKPI-В9) либо различались единичными заменами (PKPI-А2, PKPI-B1, PKPI-B2, PKPI-B10). При этом оказалось, что единственный ген PKPI-A5, имеющий меньшее сходство (95%) с генами из других сортов картофеля, отличался только по одному нуклеотиду от последовательности кДНК Cdi [AF283464], выделенной из паслена черного (S. nigrum L.), растения другого вида того же рода. Проведенный сравнительный анализ последовательностей PKPI-А и -В из различных сортов картофеля показал, что большинство из них высоко гомологичны.

Последовательности генов PKPI-С из картофеля сорта Истринский значительно отличались от известных последовательностей той же группы, выделенной из других сортов. Было показано, что последовательности трех генов (PKPI-C5, PKPI-C6, PKPI-C8) и ряда генов из других сортов различались лишь единичными заменами, гены PKPI-C1, PKPI-C2, PKPI-C3, PKPI-C4 и PKPI-C7 имели существенно меньшее сходство (89-95%) с известными последовательностями PKPI-С.

Таким образом, можно предположить, что скорость эволюции генов PKPI не столь высока, как это предполагалось ранее. Возможно, существующее их многообразие создано ограниченным числом предковых форм, общих для рода Solanum. При этом, разнообразие сочетаний этих генов в геномах картофеля современных сортов можно объяснить сложным происхождением культурного картофеля в результате скрещивания нескольких южноамериканских видов и форм картофеля с привлечением в процессе селекции различных диких видов.

2. Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI в геноме Solanum brevidens.

Для проверки гипотезы, согласно которой в геноме диких некультивируемых видах Solanum, филогенетически близких к культурному картофелю, содержатся гены идентичные или близкие по структуре генам PKPI, были клонированы гены, кодирующие белки того же подсемейства из генома неклубненосного вида S. brevidens. Клонирование проводили с помощью праймеров, разработанных для амплификации генов PKPI-A и PKPI-B из культурного картофеля.

Был создан мини-банк из 66 индивидуальных клонов. Определенные путем секвенирования нуклеотидные последовательности полученных клонов были проанализированы. При этом были реконструированы последовательности оригинальных генов, соответствующие областям, кодирующим полноразмерные зрелые белки PKPI. Гены обозначены как Spls-KPI. Из этих генов шесть относятся к структурной группе А (Spls-KPI-A1 – Spls-KPI-A6) и пять – к группе В (Spls-KPI-B1 – Spls-KPI-B5).

Сравнение последовательностей генов Spls-KPI и PKPI, выделенных в настоящей работе, а также представленных в базе данных NCBI, показало, что только два гена группы А (Spls-KPI-A1 и Spls-KPI-A3) и два гена группы В (Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B3) характеризовались относительно невысоким (96-97% идентичных нуклеотидов) сходством с известными последовательностями PKPI-A и PKPI-B из картофеля. Такой же уровень межсортовой вариабельности можно было наблюдать при сравнении последовательностей PKPI-А и -В из разных сортов картофеля.

В то же время, последовательность гена Spls-KPI-A4 была идентичной некоторым последовательностям PKPI-А из картофеля сортов Истринский и Kuras, а гены Spls-KPIA2, Spls-KPI-A5, Spls-KPI-A6, Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B3 и Spls-KPI-B5 отличались от PKPIА и PKPI-В лишь отдельными нуклеотидными заменами, по характеру и локализации совпадавшими с заменами, отмеченными при сравнении последовательностей PKPI из разных сортов картофеля.

Наличие практически идентичных генов в растениях sect. Petota ser. Potatoe (S.

tuberosum), sect. Petota ser. Etuberosa (S. brevidens) и sect. Solanum (S. nigrum), относящихся как к различным сериям Potatoe и Etuberosa секции Petota, так и к разным секциям Petota и Solanum [согласно классификации рода Solanum, приведенной в базе данных GRIN: http: //www.ars-grin.gov] свидетельствует, скорее, об относительной консервативности генов PKPI в геномах растений рода Solanum.

Эти наблюдения подтверждаются и филогенетическим анализом полноразмерных последовательностей генов, кодирующих белки PKPI из картофеля разных сортов, который проводили стандартными методами молекулярно-генетического анализа (максимальной парсимонии, UPGMA). Оказалось, что последовательности генов и кДНК, обнаруженные в разных сортах картофеля и S. brevidens, распределялись по кластерам случайным образом и не образовывали видо- или сортоспецифичных кластеров.

3. Рекомбинация генов, кодирующих ингибиторы PKPI в растениях рода Solanum.

Анализ расположения несинонимичных нуклеотидных замен, которыми отличаются между собой гены PKPI, входящие в состав какой-либо группы, показал, что они часто возникают в одних и тех же позициях и имеют неслучайный характер. Был проведен детальный анализ последовательностей генов PKPI-В и кодируемых ими аминокислотных последовательностей. Характер расположения замен аминокислотных остатков позволил выделить в последовательностях белков PKPI-В консервативные и вариабельные участки (рис. 1). Дальнейший анализ восстановленной структуры белков показал, что некоторые из выделенных вариабельных участков соответствуют областям, включающим реактивные центры. При этом остатки, функциональная значимость которых была ранее показана экспериментально, за редкими исключениями остаются строго консервативными,.

Рис. 1. Схема распределения консервативных (Cons, обозначены белым цветом) и вариабельных (Var, обозначены серым или темно-серым цветом, в зависимости от числа аминокислотных замен) участков в молекулах белков PKPI-B.

Числами отмечены положения аминокислотных остатков в последовательности белков; R и M – остатки, входящие в состав реактивных центров (Arg68, Met116, Met153);

дисульфидные связи Cys49–Cys98 и Cys147–Cys164 обозначены одной и двумя звездочками соответственно Анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей PKPI-В, соответствующих вариабельным участкам, показал, что для каждого участка существует ограниченное число возможных вариантов несинонимичных замен. На дендрограммах сравнения, построенных отдельно для каждого из этих участков, выделялись четкие кластеры, число которых соответствовало количеству возможных вариантов нуклеотидных замен. В то же время наблюдалось очевидное несоответствие результатов распределения по кластерам фрагментов последовательностей PKPI, соответствующих разным вариабельным участкам. Это дало основание предположить, что особенности структуры генов PKPI могут объясняться их происхождением в результате рекомбинации предковых форм генов.

Рис. 2. Схема распределения гомологичных участков в аминокислотных последовательностях, кодируемых генами PKPI-В из картофеля сорта Истринский и Provita [Heibges et al., 2003] и генами Spls-KPI-В из S. brevidens PKPI-В1, PKPI-B2, PKPI-B9 и PKPI-B10 из картофеля сорта Истринский; P1D4, P1G7, P1H5, P2F10, P2G2, P4D11, P4B1 из картофеля сорта Provita [Heibges et al., 2003]: SplsKPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 из S. brevidens. Гомологичные участки последовательностей обозначены серым цветом различной интенсивности. Цифрами указано положение точек рекомбинации. Пунктирной линией обозначены участки последовательностей, анализ которых не проводили.

С помощью программного обеспечения DnaSP 4.0, TOPALi v0.28 и TOPALi v2.был проведен поиск в нуклеотидных последовательностях PKPI-B областей, содержащих сайты рекомбинации. Полученные результаты позволили определить в последовательностях PKPI-В области, по которым, вероятно, происходила рекомбинация генов: 1) область 135 н.п. (соответствует положению 45 а.о в белках PKPI); 2) область н.п. (соответствует положению 57 а.о.); 3) область 230 н.п. (соответствует положениюа.о.); 4) область 355 н.п. (соответствует положению 118 а.о.) и 5) область 415 н.п.

(соответствует положению139 а.о.).

Проведенный повторный анализ нуклеотидных и кодируемых генами PKPI-B аминокислотных последовательностей с учетом полученных данных о локализации сайтов рекомбинации, позволил определить сходство фрагментов, ограниченных положением установленных точек рекомбинации (рис. 2).

4. Свойства белков, кодируемых генами PKPI-B10 и PKPI-С2 из Solanum tuberosum сорта Истринский и генами Spls-KPI группы В из Solanum brevidens.

Для проверки функциональной активности белков, кодируемых некоторыми из клонированных генов, была осуществлена их экспрессия в культуре клеток E. coli (штамм BL21(DE3)).

4.1. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белка PKPI-BРекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPI-B10, была создана на основе экспрессионного вектора pET23.

Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPI-B10, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве — в растворимой фракции клеточных белков E. coli. М. м. полученного белка имела значение около 22 кДа и совпадала с расчетной величиной, составлявшей 21,7 кДа. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pET23, не содержащим вставки, белковый продукт с такой м. м. отсутствовал.

Нерастворимая фракция с тельцами включения E. coli была солюбилизирована в денатурирующем буфере. Проведенные эксперименты показали, что ренатурация белка PKPI-B10 из полученного раствора, содержащего небелковые примеси, приводит к крайне низкому выходу целевого продукта. В связи с этим денатурированные тельца включения были очищены от белковых и небелковых примесей на колонке (2,530 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М трис-HCl-буфером, pH 8,0, содержащем 7 М мочевину.

Связавшийся с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Полученный белок был практически отделен от примесей, содержавшихся в клеточном лизате E. coli.

Было установлено, что фолдинг PKPI-B10 протекает с высокой эффективностью, как при быстром разбавлении денатурирующего раствора, так и при диализе. Основная масса белка была ренатурирована путем диализа против 0,05 M трис-НСl-буфера, pH 8,0.

Методом анионообменной FPLC-хроматографии на DEAE-ToyoPearl ренатурированный PKPI-B10 дополнительно очищали до гомогенности. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до М. Полученный белок PKPI-B10 по данным DS-Na-ПААГ электрофореза был гомогенным (рис. 3А).

Активность очищенного белка оценивали по степени подавления активности ферментов (трипсина, химотрипсина, HLE, субтилизина Карлсберг, протеиназы К и папаина) и по влиянию на рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum.

Было показано, что рекомбинантный белок PKPI-B10 не действовал на HLE, субтилизин Карлсберг и протеиназу К, но эффективно подавлял активность трипсина и в меньшей степени химотрипсина (рис. 3Б): 1 моль PKPI-B10 реагировал стехиометрически с 1 молем трипсина. В то же время зависимость степени ингибирования химотрипсина от количества добавленного белка PKPI-B10 имела нестехиометрический характер: для достижения 50%-ного ингибирования требовался более чем трехкратный избыток ингибитора.

Белок PKPI-B10 не только подавлял прорастание гиф, но и ускорял разрушение макроконидий гриба F. culmorum, являющегося возбудителем фузариозного увядания картофеля [Попкова и др., 1980] (рис. 4). При добавлении к суспензии макроконидий гриба 160 мкг белка PKPI-B10 длина прорастающих гиф уменьшалась на 50% по сравнению с контролем, а при добавлении 500 мкг обнаруживалось практически полное подавление прорастания макроконидий (кривая 1), которые при этом полностью разрушались (кривая 2).

Рис. 3. Ds-Na-ПААГ-электрофорез очищенного рекомбинантного белка PKPI-B10 (А) и его влияние на активность трипсина и химотрипсина (Б) А: 1 – Белок PKPI-B10, 2 – белки-маркеры (сверху вниз): -галактозидаза, БСА, яичный альбумин, лактатдегидрогеназа, эндонуклеаза BSP981, -лактоглобулин Б: 1 – химотрипсин, 2 – трипсин. В качестве субстратов для определения ферментативной активности использовали Suc-Gly-Gly-Phe-pNa (1) и БАПА (2) Рис. 4. Влияние рекомбинантного белка PKPI-B10 на прорастание гиф и лизис макроконидий гриба Fusarium culmorum 1 – размер гиф (% от контроля), 2 – количество лизированных конидий (% поврежденных); представлены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%.

4.2. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белка PKPI-СРекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPI-С2 была создана на основе экспрессионного вектора pQE30, содержащего 6xHis-таг на 5'-конце полилинкера.

Ожидаемый продукт экспрессии с м. м. около 22 кДа, близкой к расчетной величине 21,2 кДа для белка PKPI-С2, был обнаружен в тельцах включения, но в основном в растворимой фракции клеточных белков E. coli. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pQE30, не содержащим вставки, белковый продукт аналогичный PKPI-C2 отсутствовал.

Очистку нативно фолдировавшегося рекомбинантного белка PKPI-C2, содержащегося в растворимой клеточной фракции, проводили методом металло-хелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Полученные препараты анализировали с помощью DS-Na-ПААГ-электрофореза (рис. 5А). Активность рекомбинантного белка оценивали по подавлению активности субтилизина Карлсберг, трипсина, химотрипсина и папаина.

Было показано, что рекомбинантный белок PKPI-C2 не действовал на трипсин, химотрипсин и папаин, но подавлял активность субтилизина (рис. 5Б). Однако зависимость степени ингибирования фермента от количества добавленного белка имела нестехиометрический характер: для достижения 50%-ного ингибирования требовался двухкратный избыток ингибитора.

Из клубней картофеля сорта Истринский был выделен и очищен до гомогенного состояния белок PKSI, м. м. которого имела значение около 21 кДа (рис. 5В). Было показано, что белок PKSI не действовал на трипсин, химотрипсин и папаин, однако эффективно подавлял активность субтилизина Карлсберг (Ki=1,67±0,2 нМ). Белок PKSI взаимодействовал с ферментом стехиометрически в соотношении 1:1 (моль/моль) (рис.

5Г). Методом деградации по Эдману была определена N-концевая последовательность белка, состоящая из 19 аминокислотных остатков, которая совпала с фрагментом последовательности, кодируемой одним из изученных генов группы С.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»