WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Сперанская Анна Сергеевна ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТИПА КУНИТЦА ИЗ КАРТОФЕЛЯ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Специальность 03.00.04 – «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2008

Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Института биохимии им А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА Татьяна Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук РОТАНОВА Татьяна Васильевна доктор биологических наук КОРОЛЕВА Ольга Владимировна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ им. М.В.

Ломоносова

Защита состоится « 30 » октября 2008 г. в «14.00 » часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им А.Н.

Баха РАН по адресу:119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу:119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 стр. 1

Автореферат разослан «_29_»_сентября2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

2

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Ингибиторы протеолитических ферментов представляют собой большую группу белков, способных образовывать комплексы с протеиназами, в составе которых ферменты утрачивают свою активность. Белковые ингибиторы протеиназ, обнаруженные у представителей всех доменов живых организмов, на основании особенностей строения их молекул разделяют на структурные семейства, число которых различается в зависимости от принятой системы классификации [Laskovsky&Kato, 1980;

Rawlings et al., 2004]. Ингибиторы, принадлежащие к семейству соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI, soybean Kunitz trypsin inhibitor), широко распространены среди растений различных систематических групп, как однодольных, так и двудольных. Белки этого семейства могут подавлять активность сериновых, цистеиновых или аспартатных протеиназ, помимо этого некоторые из них проявляют активность по отношению к непротеолитическим ферментам, таким, как растительные инвертазы и -амилазы [Rodenburg et al., 1995; Heibges et al., 2003]. Белки семейства SKTI в большом количестве присутствуют в семенах и запасающих органах растений, а также в механически поврежденных или пораженных фитопатогенами органах растений.

Физиологические функции белков семейства SKTI в организме растений окончательно не установлены, тем не менее, очевидно, что они участвуют в защите растений от патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Показано, что белки SKTI могут действовать как на экстрацеллюлярные протеиназы, секретируемые фитопатогенами, так и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых, которые повреждают растительную ткань [Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с новейшими достижениями биотехнологии по созданию растений, обладающих повышенной устойчивостью к вредителям и болезням, изучение белков данного семейства имеет не только теоретическое, но также важное практическое значение.

К настоящему времени накоплено значительное количество сведений о структуре и свойствах белков-ингибиторов семейства SKTI из картофеля (Solanum tuberosum L.), являющегося одной из важнейших сельскохозяйственных культур. Эти белки выделяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz proteinase inhibitors).

Установлено, что в картофеле белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и C-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых — PKPI-A, PKPI-B и PKPI-С — относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность взаимодействия с различными протеиназами, остаются малоисследованными. Несмотря на то, что изучены биохимические свойства целого ряда белков PKPI, выделенных из клубней картофеля, их полная первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные о биохимических свойствах этих белков. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI, является актуальной задачей современной биохимии.

В настоящее время известно около сотни нуклеотидных последовательностей (в основном кДНК), кодирующих белки PKPI из различных сортов картофеля таких, как Provita, Saturna, Bintje, Pentland squire, Superior, Desire; Danshaku, Ulsten Sceptre [Heibges et al., 2003, Gruden et al., 1997; Strukej et al., 1992; Hannapel, 1993; Herbers at al., 1994;

Ishikawa et al., 1994; Stiekema et al., 1988]. Показано, что гены ингибиторов PKPI в геноме картофеля, представленные множественными копиями, отличаются высоким уровнем полиморфизма, при этом нуклеотидные последовательностями, относящиеся к трем наиболее изученным группам, различаются на 88-99% (PKPI-А), 85-99% (PKPI-В) и 5499% (PKPI-С). В то же время и последовательности кДНК (или генов) PKPI, обнаруженные в различных сортах картофеля, отличаются друг от друга. Это позволило высказать предположение, что каждый сорт картофеля содержит свой уникальный набор генов PKPI, а различия между ними обусловлены высокой скоростью их эволюции [Heibges et al., 2003]. Информация о структуре ранее не изученных генов PKPI картофеля, а также растений близких видов, представляет значительный интерес, поскольку позволяет судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.

Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение генов PKPI из генома картофеля сорта Истринский и неклубненосного дикого вида Solanum brevidens Phill.

(синоним S. palustre Poepp. ex Schltdl.), их сравнительный структурно-функциональный анализ, а также исследование взаимосвязи между структурой и специфичностью продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать метод полногеномного ПЦР-анализа генов PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C растений рода Solanum, включая установление их числа и структуры. Синтезировать универсальные олигонуклеотидные праймеры, специфичные к высоко консервативным фланговым последовательностям генов, кодирующих белки PKPI, и на их основе создать схему клонирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей из набора геномных генов PKPI картофеля сорта Истринский и неклубненосного S. brevidens.

2. Провести сравнительный анализ последовательностей реконструированных генов картофеля сорта Истринский и S. brevidens, а также известных по данным литературы последовательностей PKPI других сортов картофеля и видов растений рода Solanum. На основании полученных данных оценить скорость эволюции генов PKPI, а также перспективность поиска новых форм ингибиторов этого подсемейства в других видах растений рода Solanum.

3. Идентифицировать вариабельные и консервативные области в последовательностях генов PKPI, а также «горячие точки» рекомбинации. Усовершенствовать классификацию последовательностей в пределах групп.

4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии клонированных генов PKPI в Escherichia coli. Получить ряд рекомбинантных белков, кодируемых новыми, ранее не изученными генами PKPI, и охарактеризовать специфичность их действия на протеиназы: трипсин, химотрипсин, субтилизин Карлсберг, протеиназу К, эластазу из лейкоцитов человека (HLE) и папаин.

Научная новизна и практическая значимость работы: Впервые предложен и успешно апробирован метод полногеномного ПЦР-анализа последовательностей генов семейств PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C. Показана возможность его применения для растительных изолятов рода Solanum, включая представителей различных секций, в частности Petota.

Установлены последовательности ряда новых генов PKPI трех структурных групп PKPI-А, PKPI-В и PKPI-С, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме картофеля сорта Истринский.

Впервые установлены последовательности генов, кодирующих в геноме неклубненосного S. brevidens (Phill.) белки-ингибиторы протеиназ типа Кунитца, гомологичные белкам PKPI-А и PKPI-B из культурного картофеля. Эти гены обозначены Spls-KPI. Путем сравнительного анализа выделенных нуклеотидных последовательностей генов, а также известных по данным литературы, показано, что различия между последовательностями генов PKPI S. brevidens и S. tuberosum незначительны, а последовательности некоторых генов Spls-KPI и PKPI практически идентичны и кодируют полностью идентичные по структуре белки. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI состоят из мозаично расположенных блоков, характер локализации которых позволяет предположить, что в растениях семейства пасленовых (Solanaceae) гены PKPI подвергаются рекомбинации, которая и обусловливает природную вариабельность структуры генов, кодирующих белки PKPI в картофеле.

В нуклеотидных последовательностях генов PKPI выявлены консервативные и вариабельные области. На основании анализа доступных в литературе и определенных в настоящей работе последовательностей генов предложена модель блочной организации генов PKPI, согласно которой новые гены возникают в результате рекомбинации и обмена блоками, что сочетается со случайным мутагенезом в районе вариабельных зон.

Предложенная модель позволяет объяснить факт природной вариабельности структуры генов PKPI в картофеле и других растениях семейства Solanaceae.

Разработаны методы экспрессии генов PKPI в E. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделены, очищены и охарактеризованы рекомбинантные белки PKPI-B10 и PKPI-C2, кодируемые в геноме картофеля сорта Истринский генами PKPI-B10 и PKPIC2, а также белки Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами в геноме S. brevidens. Показано, что рекомбинантные белки не действовали на протеиназу К, HLE и папаин, но были способны с разной степенью эффективности подавлять активность трипсина, химотрипсина и субтилизина Карлсберг. Показано, что рекомбинантный белок PKPI-Bспособен подавлять рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum. Сделано заключение о возможности использования выделенных генов, кодирующих исследованные белки, для создания трансгенных растений, устойчивых к действию фитопатогенным микроорганизмов.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на III, IV и V Международных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Белоруссия, Минск, 2003, 2005, 2007); Международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Белоруссия, Минск, 2004);

Конгрессе общества SISV-SIGA (Италия, Лечче, 2004); XVI и XVII Зимних молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004, 2005); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Белоруссия, Минск, 2005), 1-ом и 2-ом Международном симпозиуме по геному пасленовых (Нидерланды, Вагенинген, 2004;

Италия, Искья, 2005); VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из которых — 6 статей и тезисов докладов.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 190 страницах; содержит рисунков и 7 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 284 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI в геноме картофеля сорта Истринский.

В клубнях картофеля сорта Истринский присутствует изоформы белков PKPI, из которых два белка, PSPI-21-5.2 и PSPI-21-6.3 (м. м. 21 кДа), были выделены и подробно охарактеризованы, а два других PSPI-22 и PCPI-23 (м. м. 22 и 23 кДа, соответственно) - лишь частично. В настоящей работе проведено клонирование генов PKPI из генома этого сорта картофеля. Для этого были синтезированы праймеры для независимой амплификации генов, относящихся к трем группам PKPI-А, PKPI-В и PKPI-С. Праймеры фланкировали области генов, кодирующие полноразмерные зрелые белки, несущие дополнительно в качестве N-концевого остаток -Asn, С-концевой остаток сигнального пептида. Кроме того, был синтезирован дополнительный праймер, с помощью которого осуществляли амплификацию фрагментов генов PKPI-С (около 450 п.н. при кодирующей области гена 650 п.н.).

Методом ПЦР-клонирования геномных генов PKPI с использованием праймеров и выделенного из проростков картофеля сорта Истринский тотального генома был создан мини-банк из 79 независимых последовательностей. Их секвенирование и последующий анализ показали, что они являются амплифицированными копиями 18 генов, из которых шесть были отнесены к структурной группе А (PKPI-A1 – PKPI-A6); четыре – к группе В (PKPI-B1, PKPI-B2, PKPI-B9 и PKPI-B10) и восемь — к группе С (PKPI-С1 – PKPI-С8).

Для большинства из перечисленных генов, за исключением двух генов (PKPI-С7 и PKPIС8), были реконструированы последовательности, соответствующие областям, кодирующим полноразмерные зрелые белки. Последовательности PKPI-С7 и PKPI-Сустановлены частично. Кроме того, было показано, что клон С12-9 на >54% отличался от других известных последовательностей PKPI, но на 98% совпадал с уникальной последовательностью кДНК S9С11 [AF460237] из картофеля сорта Saturna, условно отнесенной авторами к группе PKPI-С. Можно предположить, что в геноме картофеля присутствуют гены еще одной группы PKPI-D, кодирующие белки с неизвестными свойствами.

Анализ аминокислотной последовательности, восстановленной по нуклеотидной последовательности гена PKPI-B9, позволил определить, что он кодирует одну из изоформ двухцепочечного белка PSPI-21-6.3, выделенного ранее из клубней картофеля сорта Истринский. Аминокислотные последовательности А- и В-цепей этого белка с 1 по 178 и с 185 по 202 а.о., соответственно, и белка, кодируемого геном PKPI-B9, идентичны.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»