WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Рис. 9. Анализ состава комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином методом гельфильтрации. Комплексы были получены при A постоянной концентрации F-актина (1 мг/мл) и различных концентрациях Hsp27-3D, как описано в тексте. (А) Одинаковые количества (500 мкл) каждого образца наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex 200 HR 10/30. Кривая 1 соответствует профилю элюции изолированного Hsp27-3D (0,5 мг/мл).

Кривые 2–4 соответствуют профилям элюции 2-комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином, полученных при концентрациях добавленного Hsp27-3D, равных 1,0, 0,5 и 0,7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 мг/мл, соответственно. (Б) Зависимость Объем элюции, мл молярной концентрации Hsp27-3D, Б связавшегося с денатурированным актином, от молярной концентрации Hsp27-3D, добавленного в исходную пробу.

Как и в предыдущем случае, на 0 10 20 30 профилях элюции наблюдали по два пика Добавленный Hsp27-3D, мкM (рис. 10А). Первый пик содержал комплексы денатурированного актина и Hsp27-3D (рис. 10Б), в то время как второй пик содержал только свободный Hsp27-3D (рис. 10В). Размеры второго пика, зависели от начальной концентрации F-актина – количество свободного Hsp27-3D увеличивалось при уменьшении концентрации добавленного F-актина; из этих данных вполне можно было извлечь количественную информацию об Hsp27-3D, не связавшемся с актином. Как и в предыдущем эксперименте, сравнив площади под пиками элюции, соответствующими свободному Hsp27-3D (пики 3–7 на рис. 10А), с площадью контрольного пика, полученного для Hsp27-3D (1,0 мг/мл), прогретого в отсутствие F-актина (пик 2 на рис.

10А), мы смогли определить концентрации свободного Hsp27-3D, не связавшегося с актином. Концентрации Hsp27-3D, связавшегося с денатурированным актином, определяли путем вычитания концентрации свободного Hsp27-3D из исходной концентрации добавленного в пробу Hsp27-3D. Построив график зависимости концентрации связанного с актином Hsp27-3D от молярного соотношения F-актин/Hsp27 A, mAu Связанный Hsp27-3D, мк M а а а а Д Д а Д к Д к к Д к к 3D в исходной пробе (рис. 10Г), мы обнаружили, что кривая выходит на плато при молярных соотношениях белков 1:1. Это значит, что в состав комплексов, полученных в условиях насыщения, актин и Hsp27-3D входят в приблизительно эквимолярных концентрациях.

A 40 Г 0.0 0.5 1.0 1.7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 F-актин/Hsp27-3D (моль/моль) Объем элюции, мл Б В Рис. 10. Анализ состава комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином методом гельфильтрации. Комплексы были получены при постоянной концентрации Hsp27-3D (1 мг/мл) и различных концентрациях F-актина путем прогрева проб до 70оС с постоянной скоростью 1оС/мин. (А) Кривые 1 и 2 соответствует профилям элюции изолированного Hsp27-3D (0,5 мг/мл), негретого (1) и прогретого до 70оС (2). Кривые 3–7 соответствуют профилям элюции комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином, полученных при концентрациях F-актина 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 мг/мл, соответственно. (Б) Электрофореграмма фракций, собранных с колонки при объеме элюции 8,5–9 мл. Номера дорожек соответствуют кривым на плоте (А). (В) Электрофореграмма фракций, собранных с колонки при объеме элюции 14 мл. Номера дорожек соответствуют кривым на плоте (А). (Г) Зависимость молярной концентрации Hsp27-3D, связавшегося с денатурированным актином, от молярного соотношения F-актин/Hsp27-3D в исходной пробе.

Анализируя описанные выше данные, можно предложить следующий многостадийный механизм взаимодействия Hsp27-3D с денатурированным актином.

Тепловой денатурации F-актина предшествует его диссоциация, т.е. актиновые филаменты денатурируют не целиком, а в виде небольших олигомеров, диссоциирующих с их концов.

A, mAu Связанный Hsp27-3D, мкМ a a a D a D a k D k D D k k k Эти олигомеры актина легко подвергаются денатурации, которая в отсутствие sHSP сопровождается аморфной агрегацией. Именно с такими денатурированными олигомерами актина и взаимодействует Hsp27-3D, предотвращая их дальнейшую агрегацию путем образования относительно небольших стабильных растворимых комплексов (рис. 11).

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая F-актин (+) (-) механизм предотвращения агрегации FD D D D D D D D D D DD D D D DDDD D D D D D D D D D D D D D D D D актина в процессе его тепловой денатурации путем образования (+) (-) комплексов с sHSP. Молекулы АДФ как D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D DD D в свободном состоянии, так и связанные D D D D D D D D D D D D D D D D D с актиновыми мономерами, обозначены (-) D буквой «D». Штриховкой выделены D D актиновые мономеры или короткие D (+) D D олигомеры, отрывающиеся при нагревании с «–»-конца актинового филамента и способные присоединиться sHSP Денатурация к «+»-концу того же или другого филамента.

Агрегация Возникает вопрос – влияет ли исходное олигомерное состояние Hsp27 на его способность предотвращать агрегацию денатурированного актина и образовывать с ним растворимые комплексы Для ответа на этот вопрос мы провели сравнительный анализ процессов денатурации и агрегации F-актина в присутствии Hsp273D, представленного главным образом небольшими димерами или тетрамерами, и белка дикого типа Hsp27-wt, существующего в виде крупных олигомеров.

Сравнение свойств комплексов, образуемых Hsp27-3D и Hsp27-wt с денатурированным актином.

Для того чтобы проанализировать и сравнить влияние Hsp27-wt и Hsp27-3D на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации, мы провели ряд экспериментов по исследованию температурных зависимостей светорассеяния (рис. 12А), прогревая Fактин в отсутствие и в присутствии Hsp27-wt или Hsp27-3D в тех же условиях и с той же скоростью (1оС/мин), что и в предыдущих экспериментах с Hsp27-3D. В отсутствие Hspпрогрев F-актина сопровождался значительным приростом светорассеяния, отражающим агрегацию белка. Для проб, содержащих F-актин и Hsp27-wt или его мутантную форму Hsp27-3D, кривые зависимости светорассеяния от температуры не имеют переходов и практически не отличаются друг от друга (рис. 12А). Это свидетельствует о том, что оба D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D эти белка, несмотря на значительные различия в исходной олигомерной структуре, одинаково эффективно защищают F-актин от агрегации, вызываемой его тепловой денатурацией.

Рис. 12. Температурные зависимости А вызываемой тепловой денатурацией агрегации F-актина, регистрируемой по приросту светорассеяния (А) и по изменениям величины гидродинамического радиуса Rh, определенной методом ДЛС (Б).

Измерения температурных зависимостей светорассеяния (А) проводили при концентрации F -актина 0,5 мг/мл в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 0,мг/мл Hsp27-3D (кривая 2) или 0,125 мг/мл Б Hsp27-wt (кривая 3). Температурные зависимости Rh (Б) представлены для F актина (0,5 мг/мл) в присутствии Hsp27 3D (0,125 мг/мл) (1) или Hsp27-wt (0,125 мг/мл) 100 (2). Все эксперименты проводили со скоростью нагрева 1оС/мин. Вертикальная пунктирная линия соответствует температуре максимума теплового перехода 30 40 50 60 70 для F -актина (62оС).

Температура, oC Для более детального исследования процесса агрегации F-актина в присутствии разных форм Hsp27 мы воспользовались методом ДЛС. Для этого исследовали температурные зависимости значений Rh для образцов, содержащих F-актин и либо Hsp273D, либо Hsp27-wt. Результаты эксперимента приведены на рис. 12Б. В обоих случаях до денатурации F-актин демонстрировал хаотическое распределение значений Rh в очень широком диапазоне (от 10 нм до 1000 нм), а тепловая денатурация F-актина сопровождалась полным исчезновением компонент с высокими значениями Rh: остались только небольшие частицы со значениями Rh ~17–18 нм как в случае Hsp27-3D, так и в случае Hsp27-wt (рис. 12Б).

Мы также провели серию экспериментов по определению размеров комплексов, образованных денатурированным актином и Hsp27-wt, в зависимости от концентрации добавленного Hsp27-wt. На рис. 13 сопоставлены зависимости, полученные для F-актина, прогретого в присутствии либо Hsp27-wt, либо Hsp27-3D. Мы показали, что при значениях весового соотношения Hsp27/актин меньших или равных 1/4 кривая, соответствующая комплексам денатурированного актина с Hsp27-wt, практически полностью совпадает с кривой для комплексов с Hsp27-3D. При увеличении доли Hsp27 в пробе оказалось, что значения Rh комплексов с Hsp27-wt несколько превышают соответствующие значения для комплексов с Hsp27-3D (при весовых соотношениях Hsp27/актин, равных 1/2 и 1/4, Светорассеяние, отн.

ед.

h R, нм значения Rh составляли для Hsp27-wt 18,8 и 18 нм, а для Hsp27-3D – 15,9 и 16,5 нм, соответственно). Такое расхождение может быть следствием того, что при весовых соотношениях Hsp27/актин, превышающих 1/2, часть малых белков теплового шока остается несвязанной с денатурированным актином. Так как размеры олигомеров Hsp27-wt значительно превышают размеров димеров или тетрамеров Hsp27-3D, то эти свободные частицы могут давать дополнительный небольшой вклад в значения Rh, определяемые методом ДЛС.

Рис. 13. Зависимость значений Rh, измеренных методом ДЛС, для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D или Hsp27-wt от исходной Hsp27-3D 1: Hsp27-wt концентрации Hsp27, добавленного в исходную смесь. Концентрации Hspварьировали от 0,015 до 0,5 мг/мл, концентрация F-актина была 1:16 постоянной и составляла 0,5 мг/мл. Для каждой точки указаны весовые 1:соотношения Hsp27/F-актин в 1:1:1:исходных пробах. Средние значения Rh 15 рассчитывали из распределений, полученных при температуре 70оC в 0.0 0.2 0.4 0.режиме прогрева с постоянной sHSP, мг/мл скоростью 1оС/мин.

Таким образом, результаты экспериментов по динамическому светорассеянию свидетельствуют о том, что Hsp27-wt, подобно его мутантной форме Hsp27-3D, способен эффективно подавлять агрегацию денатурированного актина, образуя с ним небольшие растворимые комплексы.

Для более подробного сравнения свойств комплексов Hsp27-wt и Hsp27-3D с денатурированным актином мы также использовали гораздо более чувствительный метод аналитического ультрацентрифугирования. Для этих экспериментов мы использовали охлажденные пробы, полученные в экспериментах по светорассеянию (рис. 12А).

Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации для комплексов денатурированного актина с Hsp27-wt или Hsp27-3D показаны на рис. 14. В используемых условиях (при весовом отношении Hsp27/актин, равном 1/4) коэффициенты седиментации комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D распределялись в диапазоне 10-45 S, а максимум распределения находился в области 23 S (рис. 14). В случае комплексов денатурированного актина с Hsp27-wt распределение ls-g*(s) смещено в сторону больших коэффициентов седиментации (от 18 до 60 S), а его максимум составляет ~32 S (рис. 14).

Это свидетельствует о том, что комплексы, образованные денатурированным актином с h R, нм Hsp27-wt, в среднем несколько крупнее, чем комплексы, образованные с Hsp27-3D. При этом надо отметить, что большие олигомеры Hsp27-wt исходно имели коэффициенты седиментации ~15 S, что намного превосходит коэффициенты для изолированного Hsp27-3D (~ 3 S).

0. Рис. 14. Седиментационный анализ 0.комплексов Hsp27-wt (1) или Hsp27-3D (2) с денатурированным актином, полученных в результате прогрева F-актина (0,5 мг/мл) до 0.70оС в присутствии Hsp27-3D (0,125 мг/мл) или Hsp27-wt (0,125 мг/мл) и последующего 0.охлаждения до 20оС. Представлены дифференциальные распределения 0 20 40 60 80 Коэффициент седиментации, S коэффициентов седиментации ls*g(s).

Подводя итоги, следует отметить, что, несмотря на значительную разницу в исходном олигомерном состоянии, как Hsp27-3D, так и Hsp27-wt эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина, образуя с ним растворимые комплексы относительно небольшого размера. Это согласуется с данными литературы о том, что размеры комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с частично или полностью денатурированными белками-мишенями, определяются главным образом свойствами этих белков, но мало зависят от исходного олигомерного состояния sHSP. В то же время важно отметить, что средние размеры растворимых комплексов Hsp27 с денатурированным актином оказались несколько больше в случае Hsp27-wt, чем в случае Hsp27-3D (рис. 14). В литературе уже высказывалось мнение о том, что большие олигомеры Hsp27 могут представлять собой некое «депо», а их диссоциация на более мелкие олигомеры является важным условием для проявления способности Hspпредотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков. Можно предположить, что подобная диссоциация происходит и в нашем случае, при взаимодействии Hsp27-wt с денатурированным актином. Она может быть обусловлена, например, появлением белка-субстрата – частично или полностью денатурированного актина. По всей видимости, относительно небольшие олигомеры, на которые диссоциируют крупные олигомеры Hsp27-wt, все-таки существенно превышают по размерам те димеры или тетрамеры, которые образуются при фосфорилировании Hspили при его имитации в случае Hsp27-3D. Именно этим можно, по-видимому, объяснить наблюдаемую нами разницу между Hsp27-wt и Hsp27-3D в размерах растворимых комплексов, образуемых ими с денатурированным актином.

ls-g*(s) ВЫВОДЫ 1) Разработан новый экспериментальный подход к изучению влияния малых белков теплового шока (sHSP) на процессы денатурации и агрегации белков. Этот подход отработан на примере F-актина и включает параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP.

2) Показано, что sHSP не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не оказывают влияния на их тепловую денатурацию.

3) Продемонстрировано, что sHSP эффективно подавляют агрегацию F-актина, индуцированную нагреванием.

4) Установлено, что подавление агрегации F-актина осуществляется путем образования небольших по размеру, растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. Определен ряд характеристик таких комплексов – гидродинамический радиус (15–25 нм), распределение по коэффициенту седиментации и кажущаяся молекулярная масса (~2000 кДа).

5) На примере малого белка теплового шока Hsp27, существующего в виде крупных олигомеров, и его мутантной формы Hsp27-3D, имитирующей фофорилированную форму Hsp27 и представленной димерами и тетрамерами, показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP не оказывает существенного влияния на их способность предотвращать тепловую агрегацию F-актина и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»