WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

В этом же эксперименте был получен неожиданный интересный эффект – после прогрева до 70оC более 70% актина и почти весь Hsp27-3D одновременно обнаруживались в супернатанте (рис. 4Б). Полученные данные наводят на мысль о том, что после прогрева до 70–75оС малые белки теплового шока образуют с денатурированным актином комплексы, которые не осаждаются при кратковременном высокоскоростном центрифугировании. В этих комплексах актин присутствует уже не в виде филаментов Fактина, которые полностью осаждаются при ультрацентрифугировании. Это вполне согласуется с предложенной недавно моделью тепловой денатурации F-актина, согласно которой перед денатурацией происходит диссоциация актиновых филаментов на мономеры или короткие олигомеры. По-видимому, именно эти короткие олигомеры связываются с малыми белками теплового шока, которые защищают их от агрегации, – в результате образуются растворимые комплексы, не осаждающиеся при ультрацентрифугировании. Для исследования характеристик этих комплексов, таких как их размеры и стехиометрия, мы провели дополнительные исследования методами скоростной седиментации, гель-фильтрации и динамического светорассеяния.

Изучение свойств растворимых комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с денатурированным актином.

Для более подробного исследования влияния малых белков теплового шока на агрегацию F-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, мы воспользовались рядом аналитических методов. В этой серии экспериментов мы использовали малый белок теплового шока Hsp27-3D. Наш выбор обусловлен тем, что этот белок существует в виде небольших однородных олигомеров (димеров или тетрамеров) – в отличие от Hsp27-wt и многих других sHSP, которые формируют большие, неоднородные по размерам комплексы.

Метод динамического светорассеяния (ДЛС) хорошо применим для оценки размеров частиц, формируемых в процессе тепловой агрегации белка. Мы проводили эксперименты методом ДЛС в тех же условиях и при той же скорости прогрева, что и описанные выше эксперименты по тепловой денатурации, регистрируемой методом ДСК, за исключением того, что использовали более низкие концентрации F-актина (0,5 мг/мл). В этих условиях денатурация F-актина происходит в температурном интервале 55–70оС с максимумом теплового перехода при 61оС. До начала тепловой денатурации, то есть при температурах ниже 55оС, для F-актина наблюдается широкое случайное распределение значений гидродинамического радиуса (Rh) – от 10 до 1000 нм (Рис. 5А и 6A). Определить точные значения Rh для длинных актиновых филаментов разного размера практически невозможно. В отсутствие малых белков теплового шока тепловая денатурация F-актина приводит к образованию очень больших агрегатов со значениями Rh вплоть до 10 мкм (рис.

6Б). Напротив, в присутствии Hsp27-3D тепловая денатурация F-актина сопровождалась полным исчезновением компонент с высокими значениями Rh: мы наблюдали наличие лишь небольших частиц с Rh ~17 нм (Рис. 5А, 6Б). Размеры этих комплексов почти не менялись при прогреве вплоть до 80оС и увеличивались лишь при дальнейшем прогреве.

Так, после прогрева до 84оС значение Rh вырастало до 40–50 нм (рис. 5А). Важно отметить, что это значение Rh для комплексов не менялось после охлаждения до 25оС (Рис. 6Б).

Этот факт имеет большое А Б значение, так как говорит о том, что сформированные комплексы денатурированного актина с малыми белками теплового шока достаточно стабильны и уже не меняют своих размеров в 70oC зависимости от температуры и с течением времени.

0 1 2 3 4 30 40 50 60 70 Время инкубации Температура, oC при 25oC, мин Рис. 5. Формирование комплексов денатурированного актина с Hsp273D, регистрируемое методом ДЛС в процессе тепловой денатурации F-актина. (А) F-актин (0,мг/мл) прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин в присутствии Hsp27-3D (0,125 мг/мл) и строили температурную зависимость значений гидродинамического радиуса частиц (Rh), получаемых в процессе прогрева. (Б) После того, как образец прогрели до 85оС, его остудили до 25оС и построили зависимость значений Rh от времени инкубации при 25оС.

h R, нм h R, нм Рис. 6. Распределения частиц по размеру (Rh) для Fактина (0,5 мг/мл) в отсутствие и в присутствии 0.Hsp27-3D (0,125 мг/мл), зарегистрированные F-актин методом ДЛС до начала денатурации (при А 0. F-актин температуре 30–35оС) (А) и после полной тепловой + Hsp27-3D денатурации F-актина (при 70оС) (Б). Каждый 0.график был получен как среднее значение из распределений, полученных в температурном интервале 30–35оС на рис. 5А (А) или 0.распределений, полученных в интервале 69–71оС (Б).

0.0.Сходные эксперименты с использованием F-актин 0.метода ДЛС проводили в условиях, при которых Б F-актин + Hsp27-3D F-актин с постоянной концентрацией 0,5 мг/мл 0.прогревали до 70оС в присутствии Hsp27-3D при 0.различных его концентрациях – от 0,015 до 0,0.2 мг/мл (рис. 7). Хорошо прослеживается зависимость размеров комплексов Rh от 0.количества добавленного к образцу sHSP.

0.Значения Rh для комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином уменьшаются от 100 101 102 103 104 105 106 до 16–17 нм с увеличением концентрации Rh, нм Hsp27-3D в пробе от 0,015 до 0,125 мг/мл и затем не меняются при дальнейшем увеличении концентрации Hsp27-3D вплоть до 0,мг/мл. Этот результат позволяет предположить, что комплексы денатурированного актина с Hsp27-3D образуются при концентрациях Hsp27-3D, превышающих 0,125 мг/мл, т. е. в тех случаях, когда весовое соотношение Hsp27-3D/актин превышает 1/4.

Рис. 7. Зависимость значений Rh для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D от 1 : концентрации Hsp27-3D, добавленного в исходную смесь. Концентрация Hsp27-3D варьировала от 0,015 до 0,5 мг/мл, концентрация F-актина была постоянной и равной 0,5 мг/мл. Средние значения 1 : Rh рассчитывали из распределений, полученных 1 : методом ДЛС при температуре 70оC. Для каждой 1 : 1 : 1 : точки указаны весовые соотношения Hsp273D/актин в исходной смеси Hsp27-3D с F-актином.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.Hsp27-3D, мг/мл Итак, результаты, полученные методом ДЛС, отчетливо демонстрируют процесс формирования стабильных растворимых Относительная интенсивность Относительная интенсивность h R, нм комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D. Размеры таких комплексов намного меньше, чем соответствующие значения для нативных актиновых филаментов и агрегатов актина, полученных в результате прогрева F-актина в отсутствие малых белков теплового шока.

Отметим, что способ оценки размеров частиц из данных динамического светорассеяния имеет ряд определенных недостатков, один из которых – довольно низкая разрешающая способность метода. Поэтому для анализа свойств комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином мы использовали гораздо более чувствительный метод аналитического ультрацентрифугирования.

Пробы, содержащие F-актин (0,5 мг/мл) в отсутствие или в присутствии Hsp27-3D в различных концентрациях (от 0,1 до 0,4 мг/мл), а также пробу, содержащую изолированный Hsp27-3D (0,4 мг/мл), прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин до 75оС, то есть до полной необратимой денатурации актина, одновременно регистрируя кривые зависимости светорассеяния от температуры. Убедившись, что в отличие от Fактина, исследуемого в отсутствие sHSP, для проб, содержащих смесь F-актина и Hsp273D, не наблюдалось заметного увеличения светорассеяния, мы использовали эти образцы для экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию.

Прогретый до 75оС F-актин вследствие очень большого размера агрегатов осаждался еще на стадии разгона ротора, что не позволяло определить для него коэффициент седиментации. Для того, чтобы определить значения коэффициентов седиментации оставшихся полидисперсных образцов, мы воспользовались методом, предложенным Шуком. Разработанная им компьютерная программа SEDFIT позволяет выявить несколько компонентов, различающихся по величинам коэффициентов седиментации, и определить их относительное содержание. Графики распределения компонентов с различным коэффициентами седиментации для комплексов, полученных путем прогрева F-актина (0,мг/мл) до 75оС в присутствии Hsp27-3D в различных концентрациях (0,4, 0,2 и 0,1 мг/мл), а также для прогретого в тех же условиях изолированного Hsp27-3D (0,4 мг/мл) представлены на рис. 8.

Анализ седиментации прогретого Hsp27-3D демонстрирует наличие нескольких составляющих. Основной пик распределения приходится на компоненту с коэффициентом седиментации 3,1 S; помимо нее в системе присутствуют еще две компоненты с максимумами 6,7 и 8,9 S (Рис. 8Г). Этот результат хорошо согласуется с литературными данным, в которых показано, что нативный Hsp27-3D имеет коэффициент седиментации 2,7 S, что соответствует димерам. Что касается распределения c(s, f/f0) для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D, то во всех случаях распределения были представлены набором плохо разрешенных пиков, коэффициенты седиментации которых зависели от концентрации добавленного Hsp27-3D. При самой низкой концентрации Hsp27-3D (0,1 мг/мл) образцы демонстрировали коэффициенты седиментации в пределах 10–45 S (рис. 8 В). Увеличение концентрации Hsp27-3D в два раза, до 0,2 мг/мл, привело к практически полному исчезновению фракций с коэффициентами седиментации s > 30 S (рис. 8 Б). В этом случае распределение c(s, f/f0) представлено основным пиком с высокой амплитудой и максимумом при 21,6 S, и несколькими небольшими дополнительными пиками. Дальнейшее увеличение концентрации Hsp27-3D до 0,4 мг/мл привело к полному исчезновению компонент, имеющих коэффициенты седиментации выше 30 S, сужению распределения и сдвигу всей кривой в сторону более низких значений коэффициента седиментации (рис. 8А). Все распределения c(s, f/f0) для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D также содержат пик с максимумом при 3,0–3,2 S (рис. 8А–В). Этот пик отражает, скорее всего, седиментацию 0.08 димеров Hsp27-3D, не связавшихся с А денатурированным актином. С 0.увеличением концентрации Hsp27-3D в 0.пробе увеличивается и амплитуда пика с 0.максимумом в районе 3,2 S; что 0.указывает на то, что количество свободного Hsp27-3D увеличивается с 0.Б повышением концентрации 0.добавленного Hsp27-3D.

0.Рис. 8. Седиментационный анализ 0.комплексов, образуемых Hsp27-3D с денатурированным актином. Комплексы 0.В получали путем прогрева F-актина (0,0.04 мг/мл) до 75оС при постоянной скорости 1оС/мин в присутствии Hsp27-3D при 0.разных его концентрациях: 0,1 мг/мл (А), 0,мг/мл (Б) или 0,4 мг/мл (В). На плоте (Г) 0.представлено распределение коэффициентов 0.2 седиментации для изолированного Hsp27-3D (0,4 мг/мл), прогретого в тех же условиях, Г что и остальные образцы. Ультрацентри0.фугирование образцов проводили при скорости вращения ротора 30000 об/мин и температуре 20оС. Рассчитывали дифферен0.циальные распределения коэффициентов 0 10 20 30 40 седиментации с(s, f/f0); на рисунках Коэффициент седиментации, S представлены одномерные распределения по параметру s.

Проанализировав эти результаты, можно сделать вывод, что в условиях эксперимента лишь часть Hsp27-3D вовлекается в образование стабильных растворимых комплексов с денатурированным актином. Коэффициенты седиментации таких комплексов c(s,*) c(s,*) c(s,*) c(s,*) находятся в пределах 8–40 S со средним значением около 17–20 S, в зависимости от концентрации добавленного Hsp27-3D. Чем больше Hsp27-3D в пробе, тем компактнее выглядит распределение комплексов по коэффициентам седиментации и тем меньше среднее значение этих коэффициентов.

Зная общую концентрацию добавленного Hsp27-3D и определив долю свободного Hsp27-3D, мы могли бы вычислить количество Hsp27-3D, включенного в комплексы с денатурированным актином, и таким образом оценить стехиометрию Hsp27-3D/актин в этих комплексах. К сожалению, аналитическое ультрацентрифугирование не позволяет получить точные количественные данные о концентрации свободного Hsp27-3D в пробах.

Для этой цели мы воспользовались методом гель-фильтрации.

Пробы для экспериментов по гель-фильтрации готовились так же, как и для экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию, за исключением использования более высоких концентраций белков. F-актин (1,0 мг/мл) в отсутствие или в присутствии Hsp27-3D в различных концентрациях (от 0,25 до 1 мг/мл), а также изолированный Hsp27-3D (0,5 мг/мл) прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин до 68оС, то есть до полной необратимой денатурации F-актина. После охлаждения пробы подвергали ультрацентрифугированию (20 мин при 140000 g) для того, чтобы избавиться от белковых агрегатов. Cупернатанты отбирали и использовали для эксперимента по гельфильтрации. Профили элюции нанесенных образцов представлены на рис. 9А. F-актин, прогретый до 68оС в отсутствие малых белков теплового шока, осаждался во время ультрацентрифугирования, поэтому на его профиле элюции никаких пиков не наблюдалось. В тех случаях, когда F-актин прогревали в присутствии Hsp27-3D, после проведения гель-фильтрационной хроматографии этих образцов на профилях элюции можно было обнаружить два пика (рис. 9А). Согласно данным SDS-электрофореза, первые асимметричные пики, элюировавшиеся в исключенном объеме (8–10 мл), содержали в себе как актин, так и Hsp27-3D. Это свидетельствует о том, что данные пики содержали растворимые комплексы, сформированные денатурированным актином и Hsp27-3D.

Второй пик, элюировавшийся в районе 14,2 мл (кажущиеся молекулярные массы около 100 кДа), содержал только Hsp27-3D, т. е. этот пик соответствовал свободному Hsp27-3D, не связавшемуся с денатурированным актином. Размер этого пика явно увеличивался с увеличением концентрации Hsp27-3D, добавленного в пробу (рис. 9А). Для оценки концентрации свободного Hsp27-3D, площади под соответствующими пиками элюции сопоставляли с площадью контрольного пика, полученного для Hsp27-3D (0,мг/мл), прогретого в отсутствие актина. Построив график зависимости концентрации Hsp27-3D, связанного с денатурированным актином, от общей концентрации добавленного в пробу Hsp27-3D, мы попытались определить стехиометрию сформированных комплексов. К сожалению, при постоянной концентрации F-актина (24 мкМ) и концентрации Hsp27-3D, меняющейся в пределах 0–44 мкМ, мы не смогли достичь насыщения (Рис. 9Б). Поэтому мы провели сходный эксперимент, но в несколько иных условиях: теперь мы использовали постоянную концентрацию Hsp27-3D, равную 1 мг/мл (~44 мкМ), и различные концентрации F-актина – от 0,25 до 3 мг/мл (6–70 мкМ) (рис. 10).

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»