WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Для проведения таких экспериментов по соосаждению использовали ультрацентрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18о. Подготовленные растворы белков объемом 100– 200 мкл центрифугировали в течение 20 минут при 140000 g. Затем отбирали супернатанты, а осадки суспендировали в буфере того же объема, что и исходный объем образца. Содержание белков в супернатантах и осадках анализировали при помощи SDSэлектрофореза в полиакриламидном геле.

Белковый состав проб анализировали методом вертикального SDS-электрофореза по методу Лэммли. В работе использовали 13% и 15% разделяющие гели. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean 3 Сell (Bio-Rad) при постоянном напряжении 200 В. Гель окрашивали раствором Кумасси R-250. Полученные гели сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью программы ImageQuant 5.2.

Для изучения взаимодействия денатурированного актина с Hsp27-3D методом гельфильтрации использовали колонку Superdex 200 HR 10/30 (хроматограф ACTA FPLC, Amersham Pharmacia Biotech). Для этого на колонку Superdex 200, уравновешенную буфером 30 мМ Hepes/КОН (рН 7,3), содержащим 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl, наносили растворы белков объемом 500 мкл и затем элюировали со скоростью 0,5 мл/мин.

Основные результаты и их обсуждение Исследование процессов тепловой денатурации F-актина и малых белков теплового шока.

Известно, что температура максимума тепловой денатурации (Tm), измеряемая методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), для F-актина может варьировать в зависимости от условий проведения эксперимента, таких как концентрация белка, концентрация добавленных нуклеотидов и скорость прогрева, и находится в пределах 58–67оС. В природных условиях такая высокая температура может привести к гибели клетки. В работах, посвященных изучению функционирования живых организмов в условиях теплового шока, как правило, используют инкубацию при температурах 42–43оС.

Для того чтобы понять, как условия теплового шока влияют на актиновые Доля филаменты, мы провели следующий денатурированного белка эксперимент. F-актин в концентрации 1 мг/мл Светорассеяние инкубировали при постоянной температуре 43оС, через разные периоды времени отбирая аликвоты и исследуя их методом ДСК. Для того, чтобы оценить долю денатурированного 50 актина, мы из значения энтальпии (площади под кривой теплопоглощения) для нативного белка (H0 = 411 кДж/моль) вычитали 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время инкубации при 43оС, часы значения энтальпии прогретого белка для Рис. 1. Зависимости тепловой агрегации каждого момента времени, а затем F-актина, измеренной по приросту полученные величины делили на H0.

светорассеяния, и доли денатурироПараллельно с экспериментом по ДСК мы ванного белка, измеренной методом ДСК, от времени инкубации F-актина при 43оС.

Светорассеяние, отн.

ед.

Доля денатурированного Fактина, % регистрировали процесс вызываемой денатурацией агрегации F-актина, инкубируемого при 43оС, снимая зависимость светорассеяния от времени в непрерывном режиме. Мы сопоставили кривую агрегации и график увеличения доли денатурированного белка от времени (рис. 1); оказалось, что они очень хорошо коррелируют между собой. То есть, действительно, в условиях теплового шока актиновые филаменты вполне могут, подвергаться тепловой денатурации и последующей агрегации (хотя и довольно медленно).

Мы также провели серию контрольных экспериментов по исследованию тепловой денатурации различных sHSP. В таблице 1 приведены основные калориметрические характеристики для различных sHSP. Кооперативность тепловых переходов для всех малых белков теплового шока была невысокой. Полученные результаты хорошо согласуются с известными из литературы данными для некоторых sHSP.

Таблица 1. Характеристики тепловой денатурации различных sHSP, полученные методом ДСК.

Белок Tm, oC Обратимость тепловой денатурации -кристаллин 60,3 ~50% Hsp27-wt 70,8 Полностью обратима Hsp27-3D 70,0 Полностью обратима Hsp20 63,6 Необратима Hsp22 Плавится некооперативно Помимо этого, провели сравнительный анализ тепловой денатурации Hsp27 дикого типа (Hsp27-wt) и его мутантной формы с заменой трех остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты, в дальнейшем именуемого Hsp27-3D. Эти мутации, как было показано ранее, имитируют фосфорилирование Hsp27 под действием MAPKAP2 киназы, происходящее in vivo при воздействии неблагоприятных факторов и в условиях стресса. Нам не удалось обнаружить заметных различий в характере тепловой денатурации между Hsp27-wt и Hsp27-3D, что свидетельствует об отсутствии существенных различий в третичной структуре этих белков.

Для ответа на вопрос, способны ли sHSP влиять на процесс тепловой денатурации Fактина, мы воспользовались методом ДСК. Для этого мы снимали кривые теплопоглощения F-актина в отсутствие и в присутствии различных sHSP; здесь представлен эксперимент с Hsp27-3D (рис. 2А). Максимум теплового перехода F-актина в отсутствие sHSP приходился на 62оС и его денатурация была полностью необратимой. При исследовании тепловой денатурации F-актина в присутствии sHSP были получены следующие результаты. Смесь F-актина и Hsp27-3D давала точно такую же калориметрическую кривую, что и изолированный актин: максимум теплового перехода Fактина не менял своего положения, а пик, соответствующий тепловой денатурации Fактина, не менял своей формы (рис. 2А). Исходя из этих результатов, мы можем сделать вывод о том, что добавление малых белков теплового шока никак не влияет на тепловую денатурацию актиновых филаментов. Интересно, что на термограмме тепловой денатурации F-актина в присутствии Hsp27-3D пик, соответствующий денатурации самого Hsp27-3D, никак не проявлялся (рис. 2А). Однако в случае денатурации F-актина в присутствии Hsp25-wt нам удалось заметить небольшой дополнительный тепловой переход при температурах выше 80оС. Не исключено, что взаимодействие с денатурированным актином изменяет термостабильность малых белков теплового шока, защищая их от тепловой А 5 µW денатурации, которая происходит в этом случае при более высоких температурах и менее кооперативно.

Рис. 2. Температурные зависимости тепловой денатурации F-актина, регистрируемой методом ДСК (А), и вызываемой ею агрегации, регистрируемой по приросту светорассеяния (Б). Изолированный F-актин (1 мг/мл) (1), Б изолированный Hsp27-3D (1 мг/мл) (2) и Fактин (1 мг/мл) в присутствии Hsp27-3D (0,мг/мл) (3) прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин и получали кривые тепловой денатурации или агрегации методами ДСК (А) 2 или светорассеяния (Б).

30 40 50 60 70 80 90 100 Для анализа влияния sHSP на агрегацию Температура, oC F-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, мы одновременно с изучением тепловой денатурации F-актина методом ДСК исследовали температурные зависимости светорассеяния в тех же самых условиях, используя те же самые растворы белков, и с такой же скоростью прогрева. Результаты такого совместного эксперимента представлены на рис. 2. Хорошо видно, что в отсутствие малых белков теплового шока Fактин начинает агрегировать при температурах выше 55оС, а видимая температура полуперехода составляет приблизительно 62оС, что очень хорошо коррелирует с максимумом теплового перехода на кривых ДСК. В присутствии же Hsp27-3D начало агрегации заметно смещается в сторону более высоких температур, вплоть до 80оС, а полупереход – до ~85оС (рис. 2Б). Таким образом, нам удалось показать, что sHSP эффективно защищают F-актин от агрегации, вызываемой нагреванием, сдвигая кривую температурной зависимости светорассеяния F-актина в сторону более высоких температур.

Отметим, что добавление sHSP к пробе, содержащей предварительно прогретый денатурированный и агрегированный F-актин, не приводило к снижению уровня Теплопоглощение, µ W Светорассеяние, отн.

ед.

светорассеяния. Это свидетельствует о том, что sHSP препятствуют агрегации денатурированного белка, но не могут разбирать уже сформированные агрегаты.

Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина, вызываемую нагреванием Для того, чтобы более подробно изучить влияние sHSP на агрегацию F-актина, вызываемую нагреванием, мы провели серию экспериментов по изучению температурных зависимостей светорассеяния F-актина в отсутствие и в присутствии разных sHSP в Hsp27-wt A различных концентрациях. Условия во всех экспериментах были одинаковыми (30 мМ Hepes, 100 мМ KCl, 2 мМ -МЭ, pH 7,3). Прогрев проводили со скоростью 1оС/мин или 2оС/мин при концентрации актина, равной 0,25 или 1 мг/мл.

Характерные результаты (на примере Hsp27-3D и Hsp27-wt), представлены на Hsp27-3D Б рис. 3. В отсутствие малых белков 200 теплового шока F-актин начинает агрегировать при температуре ~55оС, а наблюдаемая (кажущаяся) температура 50 полуперехода составляет приблизительно 57оС, тогда как в присутствии sHSP 30 40 50 60 70 80 90 температура начала агрегации заметно Температура, oC смещается в сторону более высоких значений, вплоть до 80оС, а кажущаяся Рис. 3. Зависимость светорассеяния F-актина от температуры в отсутствие и в присутствии температура полуперехода – до ~85оС.

Hsp27-wt (А) или Hsp27-3D (Б) в различных К сожалению, за агрегацией F-актина концентрациях. Концентрация F-актина следует процесс преципитации – составляла 0,25 мг/мл (А) или 1 мг/мл (Б). Fактин прогревали с постоянной скоростью образуются огромные белковые агрегаты, 2оС/мин в отсутствие (кривая 1) или в которые оседают на дно кюветы. В присутствии Hsp27 (кривые 2–4). Весовое соотношение F-актин/Hsp27 составляло 12, 6 и результате при измерениях светорассеяния 3 для кривых 2, 3 и 4, соответственно.

невозможно наблюдать полную кривую агрегации, и, следовательно, нельзя определить точные температуры полупереходов и коэффициенты кооперативности кривых. Тем не менее, на качественном уровне очень хорошо видно, что sHSP эффективно защищают F-актин от агрегации, вызываемой нагреванием, сдвигая кривую температурной зависимости светорассеяния F-актина в сторону более высоких температур.

Светорассеяние, отн.

ед.

Необходимо отметить, что этот эффект довольно кооперативный, т. к. он наблюдается при достаточно высоких весовых соотношениях F-актин/sHSP. Для Hsp27-wt и Hsp27-3D тепловая агрегация актина подавлялась уже при весовом соотношении F-актин/sHSP, равном 12/1, что соответствует молярному соотношению F-актин/sHSP, равном ~6/1 (из расчета на мономеры белков). Важно добавить, что результаты, полученные для малых белков теплового шока дикого типа, не отличаются от результатов для их мутантов, имитирующих фосфорилирование этих белков (рис. 3). Таким образом, фосфорилирование sHSP (или его имитация) не оказывает, скорее всего, существенного влияния на их способность защищать актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией актина.

Результаты описанных выше экспериментов наглядно свидетельствуют о том, что малые белки теплового шока не влияют на тепловую денатурацию F-актина, но эффективно защищают денатурированный белок от последующей агрегации. Это наводит на мысль о том, что эти белки способны связываться лишь с денатурированным актином, но не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами. Для проверки этого предположения и выяснения механизма взаимодействия F-актина с малыми белками теплового шока нами были проведены эксперименты по соосаждению этих белков с Fактином после прогрева до определенных температур (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграммы, представляющие распределение белков (актин и Hsp27-3D) в супернатантах (с) и осадках (о) после прогрева F-актина (1 мг/мл) в отсутствие (А) или в присутствии Hsp27-3D (0,33 мг/мл) (Б) до определенной температуры. В обоих случаях пробы прогревали со скоростью 1оС/мин, при температурах 25, 75 и 90оС отбирали аликвоты, центрифугировали их в течение 15 мин при 140000g, после чего методом SDS-ПААГэлектрофореза определяли содержание актина и Hsp27-3D в осадках и супернатантах.

Препараты F-актина (1 мг/мл) в отсутствие и в присутствии малых белков теплового шока прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин в кюветах флуориметра, регистрируя зависимость светорассеяния от температуры. При определенных температурах отбирали аликвоты белковых проб, охлаждали их и подвергали ультрацентрифугированию при 140000g, после чего методом SDS-электрофореза исследовали содержание актина и sHSP в осадках и супернатантах (рис. 4). Как и ожидалось, в отсутствие sHSP нативные актиновые филаменты при комнатной температуре почти полностью обнаруживались в осадке. После прогрева до температуры 70оС и выше изолированный актин полностью денатурировал и агрегировал. Таким образом, в отсутствие sHSP актин всегда обнаруживался в осажденной фракции (рис. 4А). Затем мы исследовали соосаждение F-актина с Hsp27-3D (0,33 мг/мл) Необходимо отметить, что сам по себе Hsp27-3D, существующий главным образом в виде небольших димеров или тетрамеров, не агрегирует при тепловой денатурации и в условиях данного эксперимента не осаждается ни при комнатной температуре, ни после прогрева.

При комнатной температуре практически весь Hsp27-3D находился в супернатанте, а почти весь F-актин – в осадке (рис. 4Б), то есть в разных фракциях. Это свидетельствует о том, что малые белки теплового шока не связываются с нативными актиновыми филаментами. После прогрева до 90оС как актин, так и Hsp27-3D обнаруживаются в осадке (рис. 4Б); это значит, что взаимодействие этих белков происходит после денатурации Fактина. Этот результат вполне согласуется с современными представлениями о механизме работы малых белков теплового шока: они взаимодействуют с денатурированным белкомсубстратом за счет гидрофобных контактов.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»