WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

ПИВОВАРОВА Анастасия Викторовна Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Дмитрий Иванович Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сергей Сергеевич Шишкин доктор биологических наук, профессор Евгений Николаевич Добров

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «30» октября 2008 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 25 » сентября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актин – один из наиболее распространенных белков в природе.

Образуемые им филаменты (F-актин) являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, где содержание актина очень высоко, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения. Различные неблагоприятные условия (такие, как тепловой шок) могут приводить к денатурации актина и его последующей агрегации. Накопление агрегированного белка представляет серьезную угрозу для клетки и это особенно опасно в случае белков, представленных в большом количестве, – таких как актин. Для предотвращения формирования нерастворимых белковых агрегатов в клетке существуют различные механизмы, одним из которых является экспрессия малых белков теплового шока (sHSP).

sHSP – большая и гетерогенная группа белков с молекулярными массами от 12 до кДа, характерной особенностью которых является наличие консервативного участка (-кристаллинового домена) в С-концевой части. Многие sHSP образуют большие олигомерные комплексы, которые могут различаться по структуре и количеству мономеров. Было показано, что in vitro они могут функционировать как молекулярные шапероны и предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков, причем эта их способность зависит от четвертичной структуры sHSP. В клетках многие sHSP подвергаются фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что сопровождается изменением их олигомерного состояния и шаперонной активности.

К настоящему времени в литературе накоплен огромный материал о защитном действии sHSP на агрегацию различных белков-мишеней в процессе их денатурации. При этом, однако, конкретный молекулярный механизм такого шаперонного действия sHSP оставался зачастую совершенно неясным. Так, например, не было однозначного ответа на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP:

влияют ли они на денатурацию белка-мишени, приводящую к его агрегации, или же лишь препятствуют агрегации частично или полностью денатурированного белка. Многие авторы, наблюдая in vitro лишь подавление агрегации различных белков-мишеней малыми белками теплового шока, делали вывод о том, что sHSP препятствуют денатурации исследуемого белка, не имея на то достаточных оснований.

В ответ на различные неблагоприятные воздействия, такие как тепловой шок, экспрессия некоторых sHSP (B-кристаллин, Hsp27) значительно увеличивается, и их наибольшее количество обнаруживается именно в мышечных тканях, где содержание актина также очень велико. Можно предположить, что одна из функций таких sHSP заключается во взаимодействии с актином. В ряде исследований были сделаны попытки проанализировать взаимодействие некоторых sHSP (B-кристаллин, Hsp27, Hsp20) с нативными актиновыми филаментами. Результаты этих исследований, однако, весьма противоречивы и не подтверждают того, что sHSP могут связываться с нативным F актином. Было показано, что в ответ на стресс sHSP могут перемещаться из цитозоля и локализоваться в области цитоскелета, причем такое перемещение может приводить к стабилизации актиновых филаментов. Исходя из этих данных, более вероятным кажется предположение, что sHSP взаимодействуют с актином только при неблагоприятных условиях, таких как тепловой шок, но конкретный молекулярный механизм этого взаимодействия оставался до недавнего времени совершенно неясным. В частности, оставалось неясным, способны ли sHSP взаимодействовать с нативными актиновыми филаментами и оказывать влияние на их денатурацию. Все еще оставалось неизвестным, какую роль в защите актина от агрегации может играть фосфорилирование sHSP и их олигомерное состояние. Выяснение этих вопросов и составило главную цель данной диссертационной работы.

Цель и задачи работы. Итак, целью работы было детальное изучение защитного действия малых белков теплового шока на агрегацию актиновых филаментов, вызываемую их тепловой денатурацией. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние sHSP на тепловую денатурацию F-актина.

2. Проанализировать процесс агрегации F-актина при его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии sHSP.

3. Сравнить шаперонные свойства нефосфорилированного малого белка теплового шока и его мутантной формы, имитирующей фосфорилирование.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Малые белки теплового шока эффективно защищают актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией, но при этом они не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не оказывают влияния на сам процесс тепловой денатурации F-актина.

2. Защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов малых белков теплового шока с денатурированным актином.

3. Исходное олигомерное состояние малых белков теплового шока, определяемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP предотвращать агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Научная новизна. Разработан новый подход на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для исследования взаимодействия sHSP с F-актином в процессе его тепловой денатурации. Впервые удалось получить ответ на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP, – а именно выяснить, что они предотвращают тепловую агрегацию белкамишени, но не препятствуют его тепловой денатурации, предшествующей агрегации.

Установлено, что защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. При совместном использовании методов ДСК, динамического светорассеяния, седиментационного и флуоресцентного анализа проведены исследования свойств таких комплексов. Показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP, вызываемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином. Получены данные, впервые позволяющие описать механизм защиты актинового цитоскелета от аморфной агрегации, приводящей к гибели клеток при различных неблагоприятных воздействиях.

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области механизма, лежащего в основе шаперонной активности sHSP, и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии. Разработанный нами экспериментальный подход – параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP, может использоваться (и уже успешно используется) для изучения взаимодействия sHSP с другими белками-мишенями.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2004; 2006; 2008), на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005» (г. Москва, 2005), на 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (о. Эльба, Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005; г. Гейдельберг, Германия, 2006), на 30-м Международном конгрессе FEBS (г.

Будапешт, Венгрия, 2005), на 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (г.

Будапешт, Венгрия, 2007) и на конкурсе лучших научных работ, выполненных в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2005 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (источников). Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 35 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах F-актина и малых белков теплового шока, а также анализируются имеющиеся в литературе данные о взаимодействии между этими белками.

Материалы и методы исследования Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации. За час до использования мономерный G-актин полимеризовали, добавляя MgCl2 до конечной концентрации 2 мМ, и использовали в Fформе. Рекомбинантные малые белки теплового шока Hsp25-wt (белок дикого типа), Hsp25-3D (мутант с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 77 и 81 на остатки аспарагиновой кислоты), Hsp27-wt, Hsp27-3D (мутант с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) и Hsp20 были любезно предоставлены профессором Н.Б.

Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова).

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Все эксперименты проводили в буфере 30 мМ Hepes/KOH (pH 7,3), содержащем 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl (или KCl). Для получения кривых теплопоглощения препарат белка или смеси белков с концентрацией 0,5–3,0 мг/мл в соответствующем буфере помещали в ячейку прибора и прогревали со скоростью 1–2oC в минуту с 10 до 90оС при постоянном давлении 2,2 атм. Базовую линию записывали, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения образцов проводили их повторное сканирование.

Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения “Origin 1.16” и “Origin 7.0” фирмы “MicroCal” (США).

Калориметрическую энтальпию (Нcal) определяли как площадь под пиком теплопоглощения.

Процесс тепловой агрегации F-актина контролировали, регистрируя температурные зависимости светорассеяния F-актина как в присутствии, так и в отсутствие sHSP.

Светорассеяние измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Varian), инкубируя образец при постоянной температуре 43oC или нагревая его с постоянной скоростью 1°С в минуту от 25°С до 75–90°С при скрещенных монохроматорах и длине волны 350 нм.

Одним из методов, используемых для характеристики формы и размера макромолекул в растворе, является аналитическое ультрацентрифугирование. Опыты по седиментации проводили на аналитической ультрацентрифуге «Beckman» модели Е.

Образцы белков центрифугировали в роторе на 6 двухсекторных ячеек с использованием контрбаланса. Через определенные промежутки времени после достижения скорости вращения ротора 30000, 40000 или 56000 об/мин регистрировали распределение вещества, поглощающего при 290 нм, по длине ячейки. Для получения данных в цифровом виде было использовано программное обеспечение, разработанное А.Г. Жаровым (www.ADClab.ru). Для определения коэффициента седиментации и коэффициента диффузии использовали уравнение Ламма, моделирующее распределение вещества в секторной ячейке при ультрацентрифугировании. Для решения этого уравнения и анализа получаемых седиментограмм использовали программу SEDFIT (http://www.analyticalultracentrifugation.com).

Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС) широко используется для определения размеров наночастиц в анализируемой суспензии по измерению динамики флуктуаций (колебаний) интенсивности рассеянного света. Исследования проводили при помощи коммерческой установки фотометра рассеянного лазерного света Photocor (Photocor Instruments Inc., USA; www.photocor.com), с He–Ne лазером мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632,8 нм. Сигнал светорассеяния от образца наблюдали под углом 90о. Температуру образца можно контролировать при помощи ПИД (пропорционально-интегрально-дифференциального) регулятора PhotoCor-TC, с точностью до ± 0,1°C; такой регулятор позволяет также осуществлять нагрев образца с постоянной скоростью. Анализ данных и контроль работы прибора выполняли с помощью программы PhotoCor версии 5.3.3. Анализ корреляционных функций для полидисперсных частиц проводили при помощи программного обеспечения DynaLS (Alango, Израиль), версия 2.5.2.

При центрифугировании на больших скоростях филаменты актина осаждаются.

Если в растворе есть небольшие молекулы, способные связываться с актиновыми филаментами, то они также будут обнаруживаться в осадках вместе с ними.

Следовательно, анализируя осадки и супернатанты после ультрацентрифугирования, можно делать выводы о способности небольших белков взаимодействовать с F-актином.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»