WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Lb из клубеньков бобов Mb кашалота Hb быка Hb человека цитохром с из сердца лошади 0 20 40 60 время, ч Рис. 9. Изменение интенсивности флуоресценции гемопротеидов, инкубированных с метилглиоксалем (возб=320 нм, исп=390 нм).

Как видно из рисунка 9, легоглобин в большей степени подвержен модификации метилглиоксалем, чем другие исследованные гемопротеиды. Нами было установлено, что по степени модификации легоглобин занимает промежуточное положение между гемоглобинами и альбуминами. В данной реакции в легоглобинах могут участвовать как поверхностные группы, так и гем.

Спектры испускания флуоресценции модифицированного метилглиоксалем легоглобина бобов (120 ч инкубации) (рис. 10) по структуре были идентичны аналогичному спектру легоглобина, выделенного из клубеньков бобов, после обработки t-BOOH (рис. 11 B, врезка). Поэтому мы пришли к выводу, что легоглобиновая фракция клубеньков бобов содержала определенную долю гликозилированного белка, который устойчив к действию гидропероксидов.

Lb Lb-MG (20 ч) Рис.10. Спектры флуоресценции Lb-MG (120 ч) (возбуждение max=320 нм) Lba из клубеньков бобов, нативного и обработанного метилглиоксалем (20 и 120 ч инкубации при молярном соотношении Lb : MG = 1:200).

335 385 435 485 535 нм отн. ед.

Интенсивность флуоресценции отн. ед.

Интенсивность флуоресценции, В наших экспериментах мы не наблюдали изменений в спектрах флуоресценции бобового Lba, предварительно модифицированного метилглиоксалем (120 ч), при добавлении t-BOOH. В аналогичном опыте с модифицированным соевым легоглобином (Lb-Y и Lb-Z) происходило уменьшение одного из максимумов флуоресценции (исп= нм) (рис. 11 А), однако окончательный спектр был подобен спектру модифицированного бобового Lbа (рис. 10 и рис. 11 В, врезка). Вероятно, эти изменения были вызваны разрушением под действием t-BOOH продуктов гликоокисления, отличных от конечных продуктов превращения метилглиоксаля.

Как видно из рис. 11 С, инкубация с t-BOOH приводила к практически полному исчезновению флуоресценции при 395 нм бобового Lba в отличие от модифицированного Lb-Z. Этот факт показывает, что продукты гликозилирования легоглобина, отвечающие за флуоресценцию в области 395 нм, могут защищать белок от окислительной деструкции, вызванной t-BOOH, подвергаясь при этом структурным изменениям.

А B 40 330 380 430 480 530 330 380 430 480 530 330 380 430 480 530 Длина волны, нм Длина волны, нм С Рис. 11. Спектры флуоресценции (возбуждение max=320 нм) Lbа (черная линия) и Lb, инкубированного с t-BOOH (1:355 мкМ) в течение ч (серая линия). A. Lb-Z из E. coli. B. Lbа из клубеньков бобов (на врезке - спектр флуоресценции после обработки t-BOOH). С.

Изменение интенсивности флуоресценции max=395 нм при взаимодействии с t-BOOH (1:3550 мкМ) бобового Lba (штрихпунктирная) и 0 2 4 6 8 10 соевого Lb-Z (сплошная линия).

время, мин Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

% от исходного уровня Интенсивность флуоресценции, 2.4. Восстановительные свойства модифицированного Lbа сои При исследовании гликозилированных белков неясными остаются вопросы о физиологическом и патологическом значении этой посттрансляционной модификации.

При выращивании клеток, содержащих Lb-Z, в присутствии Bv, рост клеток не ингибировался в течение 4-х часов, в отличие от клеток, содержащих oxyLb (рис. 12). Также было показано, что при увеличении концентрации Bv происходила деградация Lb (рис. А). Неаэрируемые клетки, предварительно культивируемые с различными дозами Bv, обладали различной скоростью восстановления этого вещества (рис. 13 В), которая коррелировала с количеством оставшегося модифицированного легоглобина в клетках (рис.

13 А). Это указывает на возможность того, что модифицированный Lb способен выступать в качестве донора электронов на компоненты дыхательной цепи. Кстати, имеются работы, в которых показано, что в анаэробных условиях гликозилированные аминокислоты способны восстанавливать цитохром с (Степуро с соавт., 1997; 1999).

А В 0,0,0,0,0,0,0,0, 0,0,0,3 0,0,0,0,0,0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 ч роста ч роста Рис. 12. Кривые роста клеток E. coli, содержащих Lb-Z (А) и LbО2 (В) в присутствии различных концентраций бензилвиологена: без Bv (черная линия), 125 мкМ (черная пунктирная линия), 250 мкМ (серая линия), 375 мкМ (серая пунктирная линия).

Бензилвиологен вносили в среду после 2 ч инкубации клеток в среде LB.

Известно, что такая посттрансляционная модификация, как гликозилирование, изменяет структуру, функции и физико-химические свойства белков. Принимая во внимание обнаруженное в описанных выше опытах протекторное действие модифицированного Lbа в условиях окислительного стресса, мы решили проверить наличие пероксидазной активности у этих модифицированных легоглобинов. Было показано, что модифицированные легоглобины достаточно эффективно катализируют восстановление пероксида водорода, в том числе и без внешних доноров электронов, то есть проявляют каталазную активность.

А (600 нм) А (600 нм) А В 1,0,0, 0,0, 0 500 1000 1500 Lb-Z LbOвремя, с Рис. 13. А. Количество Lbа в клетках E. coli Lb-Z и LbO2, выращенных в присутствии различных концентраций Bv. В. Динамика восстановления Bv клетками E. coli с Lb-Z. Цвет столбцов и кружков соответствует определенной концентрации Bv: 125 мкМ (белый), мкМ (серый) и 375 мкМ (черный).

Кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в случае Lb-Y и Lb-Z имела явно выраженный индукционный период, что, по-видимому, связано с установлением равновесия между реакциями восстановления перекиси и восстановления кислорода. При определенных концентрациях субстрата реакция протекала в автоколебательном режиме.

Табл.1. Скорости каталазной реакции, катализируемой модифицированными Lb V (Моль/мин·мг белка) Комплексы Lb [H2O2]=1, 47 мМ [H2O2]=8,82 мМ Lb-Y 0,32±0,02 2,76±0,Lb-Z 0,18±0,02 0,73±0,Мы полагаем, что значительную роль в активации пероксидазной активности легоглобина при его модификации продуктами превращения углеводов играют изменения окружения гема и конформационные перестройки. Как видно из рис. 14, спектр КД гликозилированного Lba имел интенсивную положительную полосу в области Соре, в отличие от нативного Lba. Такое изменение знака в полосе Соре, как показано для гемоглобинов (Nicola et al., 1975), зависит от вклада ароматических групп, окружающих гем, которые в случае Lb-Z появились в результате модификации гемового кармана продуктами гликоокисления.

А (550 нм) Lb мкг/ мг белка [] (град·см2·дмоль-1) Рис. 14. Спектры кругового дихроизма соевого Lba в 0,02 М К-фосфатном буфере (рН 7,2). Верхняя серая линия Lb-Z, нижняя черная линия Lb(III)-OH-.

Ранее было показано наличие в клубеньках сои, фасоли и вигны низкомолекулярного неферментативного -восстановителя – соединения В (Becana, Klucas, 1990).

-Впоследствии в работе, выполненной в нашей лаборатории -(Шлеев, 2000), в цитозоле клубеньков желтого люпина -были обнаружены аналогичные соединения, которые 350 400 450 500 550 600 получили обозначение R и B’. В работе С.В. Шлеева было длина волны, нм показано, что соединение R быстро восстанавливает различные гемсодержащие белки (Lb, Mb и Hb) в отсутствие искусственных переносчиков и доноров электронов. Характеристики спектров поглощения и флуоресценции соединений B и R были близки к спектрам веществ, имеющих в своем составе имидазольный и/или индольный циклы. Изучение электрохимических свойств соединения R показало, что восстановление Lb компонентом R осуществляется по одноэлектронному механизму (Шлеев, 2000). В работе (Becana, Klucas, 1990) было установлено, что соединение В восстанавливает гемопротеиды через О2•-. Однако несмотря на проведенные исследования, природа низкомолекулярных восстановителей до настоящего времени оставалась неизвестной.

На основании обобщения экспериментальных данных в работе (Шумаев с соавт., 2008) был предложен механизм образования О2•- в результате восстановления Освободнорадикальными интермедиатами метилглиоксаля, образующимися в ходе реакции Lлизина с метилглиоксалем. Принимая во внимание этот факт, а также характеристики низкомолекулярных восстановителей и лигандов Y, Y’ и Z, мы пришли к заключению, что этими восстановителями неизвестной природы являются продукты гликозилирования аминокислот и небольших пептидов. Восстановительные свойства соединений Y, Y’, Z, B и R связаны с наличием в их составе как индольного цикла, так, возможно, и с их способностью генерировать супероксид, аналогично лизину, модифицированному метилглиоксалем.

3. Антиоксидантное действие ДНКЖ, ассоциированных с Hb Гемоглобины в биологических системах в условиях окислительного и нитрозативного стрессов играют противоречивую роль. С одной стороны, гемоглобины обладают рядом антиоксидантных функций. Гемоглобины могут восстанавливать пероксиды, восстанавливать и окислять NO, а также катализируют реакцию изомеризации пероксинитрита в нитрат. С другой стороны, гемоглобины являются основной мишенью действия органических перекисей (Gorbunov et al., 1995; Reeder and Wilson, 2005), что приводит к образованию таких активных интермедиатов, как оксоферрилгемоглобин (HbFeIV=O), алкокси- (RO•) и алкилпероксильные (ROO•) радикалы в следующих реакциях (Zee, 1997; Kagan et al., 2001):

Hb-FeIII + ROOH Hb-FeIV=O + RO• + H+ (5) Hb-FeIII + ROOH Hb•-FeIV=O + ROH (6) Hb•-FeIV=O + ROOH Hb-FeIV=O + ROO• + H+ (7) Hb-FeIV=O + ROOH Hb-FeIII-OH + ROO• (8) Таким образом, гемоглобины, в отличие от каталаз и гемсодержащих пероксидаз, стимулируют процессы перекисного окисления.

В настоящее время установлено, что важную роль в ходе окислительного стресса играют ДНКЖ низкомолекулярные и связанные с белками (Шумаев с соавт, 2006). В частности, ДНКЖ могут ассоциироваться на SH-группах цистеинов -субъединицы Hb (Vanin et al., 1998; Gow et al., 1999). В то же время эти группы одними из первых подвергаются окислительной модификации в условиях генерации активных форм кислорода и азота.

Спектры ЭПР спиновых аддуктов DEPMPO показывают, что при взаимодействии гемоглобина с гидропероксидом трет-бутила образуются алкилпероксильные радикалы и свободные радикалы аминокислотных остатков белка, в том числе тирозиновые и тиильные радикалы (Рис. 15, А и B).

Однако при взаимодействии гидропероксида трет-бутила с Hb-ДНКЖ выход свободнорадикальных интермедиатов снижается (Рис. 15 А, спектры 3-5). Причем максимальное уменьшение уровня тиильного радикала наблюдается при эквимолярных концентрациях гидропероксида трет-бутила и ДНКЖ-Hb (Рис. 15 А, спектры 4 и 5). Эти данные свидетельствует о том, что ДНКЖ перехватывают свободнорадикльные интермедиаты, реагирующие с SH-группой цистеина.

На рисунке 16 методом электрофореза показано образование димеров Hb, образующихся при обработке его различными концентрациями пероксида водорода.

Пероксид водорода в концентрации 400 и 800 мкМ вызывает образование димеров субьединиц гемоглобина (Рис. 16 A, линия 2 и 3). Известно, что формирование таких димеров может быть следствием образования дисульфидной связи между остатками цистеинов -93 и димеризации тирозиновых свободных радикалов (Romero et al., 2003). Под действием пероксида водорода в концентрации 1600 мкM наблюдается фрагментации белковой цепи (Рис. 16 A, линия 4). В то же время видно, что ДНКЖ эффективно ингибируют окислительную модификацию связанного с ними гемоглобина (Рис. 16 B).

Необходимо отметить, что ДНКЖ после распада практически не ингибируют окислительную модификацию metHb (Рис. 16 C).

o o o 3000 o o B A o o o o o o o o 2500 o 2000 1500 1000 500 320 324 328 332 320 324 328 Магнитное поле, мТл Магнитное поле, мТл Рис. 15. Cпектры ЭПР спиновых аддуктов DEPMPO.

А. Cпиновый аддукт DEPMPO со свободными радикалами, образующийся после добавления к 235 мкМ metHb 0,8 мМ (2) или 0,4 мМ (4) t-BOOH и добавлением к 340 мкМ Hb-ДНКЖ 0,мМ (3) или 0,4 мМ (5) t-BOOH к реакционной смеси.

Реакционная смесь содержала 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,4), 40 мМ DEPMPO и 1,6 мМ ДТПА. Спектры (А1) показывают сумму ЭПР спектра спинового аддукта, рассчитанного по следующей формуле: (А1)=0,75(B1)+(B2)+0,2(B3).

В. Cпиновые аддукты с тиильными (1) и тирозиновыми (3) радикалами и свободнорадикальные продукты t-BOOH (2).

Рис. 16. Определение окислительной модификации гемоглобина Н2О2 с помощью SDS-электрофореза в15 % ПААГ. А гемоглобин; B Hb-ДНКЖ; C – Hb-ДНКЖ после распада 1 – контроль (без H2O2); 2 - 400 мкМ; 3 - 800 мкМ; 4 -1600 мкМ.

Сигнал ЭПР, отн.ед.

ВЫВОДЫ 1) Показано, что легоглобин способен связывать оксид азота двумя способами, исключая его из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления;

2) Легоглобин может функционировать и как про-, и как антиоксидант, причем проявление им этих свойств зависит от его концентрации в клетках;

3) Обнаружено образование модифицированного легоглобина в клубеньках гороха и клетках E. coli, экспрессирующих его;

4) Показано, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда;

5) Модифицированный легоглобин имеет гемохромный характер спектра и способен восстанавливать бензилвиологен in vivo, то есть функционирует как донор электронов;

6) Модифицированный легоглобин (комплексы Lb-Y и Lb-Z) является эффективным катализатором реакции разложения Н2О2 в отсутствие внешних восстановителей;

7) Показано, что динитрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, действуют как сайт-специфические антиоксиданты, защищающие белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Космачевская О.В., Топунов А.Ф. Метод определения содержания гемоглобинподобных белков в гетерогенных смесях. // Прикл. биохимия и микробиология.

2007. Т. 43. № 3. С. 347-353.

2. Kosmachevskaya O.V., Shumaev K.B., Arredondo-Peter R., Topunov A.F. Influence of tert-butyl hydroperoxide and nitrosoglutathione on Esherichia coli cells expressing leghemoglobin.

// J. Stress Physiology & Biochemistry. 2007. V. 3. N 1. P. 18-24.

3. Shumaev K.B., Kosmachevskaya O.V., Timoshin A.A., Vanin A.F., Topunov A.F.

Dinitrosyl iron complexes bound with haemoglobin as markers of oxidative stress. // Methods in Enzymology. 2008. V. 436. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins. P. 441-457.

4. Shumaev К.B., Gubkin А.А., Serezhenkov V.А., Lobysheva I.I., Kosmachevskaya O.V., Ruuge E.К., Lankin V.Z., Topunov А.F., Vanin А.F. Interaction of reactive oxygen and nitrogen species with albumin- and hemoglobin-bound dinitrosyl iron complexes // Nitric Oxide. 2008. V.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»