WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

S-нитрозоглютатион в концентрациях до 200 мкМ существенно не ингибировал рост исследуемых бактериальных культур. Более того, рост всех типов клеток E. coli в условиях индуцированного t-BOOH окислительного стресса стимулировался GSNO (рис. 1). Защитный эффект GSNO являлся дозозависимым. Следует отметить, что восстановление роста бактериальных культур наблюдалось даже при добавлении GSNO вместе с t-BOOH, при концентрациях последнего, вызывавших практически полное подавление роста исследуемых штаммов.

Роль оксида азота в биологических системах двойственна. С одной стороны, NO и другие активные метаболиты азота обладают цитотоксическим действием, а, с другой, NO способен непосредственно взаимодействовать с возникающими в ходе окислительного стресса феррилгемопротеидами и органическими радикалами (Bastian et al., 2002) в соответствии с реакциями:

гем-FeIV=O•+ NО• гем-FeIII-ONO гем-FeIII + NO2- (1) NО• + RО2• ROОNО (2) Протекторные свойства NO могут проявляться при восстановлении t-BOOH согласно реакции (Gorbunov et al., 1997):

Fe(II)-NO + t-BOOH +H2O Fe(III) + t-BOH + HNO2 + OH- (3) В то же время эффект совместного действия GSNO и бензилвиологена существенно отличался от такового при действии GSNO совместно с t-BOOH. В случае Bv мы наблюдали отсутствие защитного действия GSNO (рис. 1), хотя бензилвиологен также, как и гидропероксид трет-бутила, является индуктором окислительном стресса.

Гемоглобин является уникальным белком, поскольку способен связывать NO тремя различными способами (рис. 2). Оксид азота может взаимодействовать с гемовой группой и остатками цистеина с образованием нитрозилгемоглобина (HbFe(II)NO) и Sнитрозогемоглобина соответственно. Кроме того, с участием различных белковых групп, в первую очередь тиолсодержащих, могут формироваться динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ). Впервые образование ДНКЖ в биосистемах было показано в клетках дрожжей Ваниным (Ванин, Налбандян, 1965).

t -BOOH Bv LbLb+50 Lb+ 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 ч роста ч роста GSNO + t -BOOH GSNO + Bv 80 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 ч роста ч роста GSNO Рис. 1. Влияние редокс-медиаторов на рост E. coli. Bv0,125 мМ;

t-BOOH 0,04 мМ; GSNO0,2 мМ.

0 5 10 15 20 25 ч роста В наших экспериментах мы также наблюдали сигнал белковых ДНКЖ как в контрольных клетках, так и в клетках, синтезирующих легоглобин, инкубированных с нитрозоглютатионом (рис. 3). В случае легоглобинсодержащих клеток, инкубированных с GSNO и t-BOOH, мы наблюдали спектр, являющийся суперпозицией двух спектров ДНКЖ и нитрозилLb, который отсутствовал в контрольных клетках (рис. 3).

рост, % от контроля рост, % от контроля рост, % от контроля рост, % от контроля рост, % от контроля NO Men+ Me(n-1)+ O2•OHb NO+ ONOO- NOOH O2N NO+ NO S RS NO N Fe N S-нитрозилирование Fe2+ L NO+ CHN N L2 Fe+ (NO+)2 L = PO4, RS-, Нитрирование (Tyr) N R1N=RОбразование белковых и Нитрозилирование гема низкомолекулярных ДНКЖ Рис. 2. Взаимодействие NO с гемоглобинами.

Это показывает, что в С+Lb имеются разные пути утилизации оксида азота. Из рис. также видно, что гидропероксид трет-бутила не приводил к существенным изменениям в спектрах ЭПР бактериальных культур, но снижал уровень образующихся в них ДНКЖ.

Интенсивность сигнала ДНКЖ при инкубации контрольных клеток с t-BOOH уменьшалась ~ на 40%. В аналогичных условиях в культуре С+Lb, сигнал ЭПР ДНКЖ снижался лишь ~ на 10%. Этот эффект может быть обусловлен, с одной стороны, деструкцией ДНКЖ при взаимодействия со свободными радикалами и оксоферрилгемопротеидами, с другой, пероксидазной активностью легоглобина, защищающей ДНКЖ от окислительной деструкции.

Более низкий уровень ДНКЖ в культуре С+Lb, по сравнению с С-Lb, при инкубации только с GSNO (рис. 3) можно объяснить процессом окисления NO оксигенированным легоглобином, что приводит к снижению концентрации оксида азота в системе согласно реакции:

LbO2 + NO Lb(III) + NO3- (4) С помощью метода ЭПР мы показали возможность образования нитрозиллегоглобина in vitro. На рисунке 4 изображены характерные низкотемпературные спектры нитрозилированного по железу гемовой группы гемоглобина и полученного в аналогичных условиях нитрозилированного легоглобина. Как видно, значения g-факторов для обоих спектров совпадают.

На основании полученных данных можно утверждать, что связывание легоглобином NO имеет протекторное значение в условиях окислительного стресса. С одной стороны, это приводит к выведению NO из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления. С другой стороны, NO, как гемовый лиганд легоглобина, ингибирует образование феррилформы при взаимодействии легоглобина с гидропероксидами.

A B 3000 2500 2000 280 300 320 340 360 380 280 300 320 340 360 Магнитное поле, мT Магнитное поле, мT Рис. 3. Низкотемпературные спектры ЭПР клеток E. coli C-Lb А и C+Lb B.

1-не обработанные бактерии; 2- бактерии после инкубации с t-BOOH; 3- после инкубации с GSNO; 4- после инкубации с GSNO и t-BOOH.

XX g=2,ДНКЖ-POHb-ДНКЖ Lb-ДНКЖ 280 320 320 Магнитное поле, мT Магнитное поле, мT Рис. 4. Спектры ЭПР нитрозилHb (А), ДНКЖ-PO4 (B, 1) и нитрозилLb (B, 2).

сигнал ЭПР, отн. ед.

сигнал ЭПР, отн.ед.

2. Модифицированные легоглобины 2.1 Образование модифицированных Lb in vivo Помимо способности взаимодействовать с классическими низкомолекулярными лигандами, многие гемоглобины способны формировать прочные комплексы и с довольно крупными молекулами, например, с ароматическими и гетероциклическими соединениями с атомом азота (нитрозобензолом (Murayama, 1960), изохинолином (Сафонова с соавт., 1991), никотиновой кислотой (Appleby et al., 1976; Lee et al., 1995) и др.) Используемая в наших исследованиях модель клетки E. coli со встроенным геном Lba сои, позволяет спектрофотометрически регистрировать состояние Lb в целых клетках.

При росте в условиях нормальной аэрации (коэффициент заполнения колбы = 0,10,3) клетки имели розовый цвет благодаря наличию в них LbO2. Оптический спектр целых клеток являлся характерным спектром восстановленного оксигенированного Lb (541 и 575 нм) (рис.

5 А). Это свидетельствует о том, что в клетках E. coli имеются вещества, возможно и белковой природы, способные восстанавливать Lb и, тем самым, поддерживать его в функциональном состоянии. Отметим, что ранее в нашей лаборатории в клетках E. coli был обнаружен фермент, способный восстанавливать гемоглобинподобные белки (Талызин с соавт., 1988).

При выращивании культуры в условиях с уменьшенной аэрацией, мы получали клетки, имеющие не розовую, а оранжевую окраску. Такое изменение окраски клеток отражало изменение состояния Lb. Спектры поглощения, снятые с этих клеток, имеют гемохромогенный характер, что свидетельствует о том, что Lb в этих условиях представляет собой гемохром (522 и 552 нм) (рис. 5 В).

0,А 0,45 B 0,0,0, 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, 400 450 500 550 390 420 450 480 510 540 570 нм нм Рис. 5. Спектры поглощения целых клеток E. coli, содержащих LbO2 (А) и Lb-Z относительно клеток С-Lb (В).

А А В зависимости от природы соединения легоглобин приобретал специфическую окраску, что отражалось и на цвете клеток: Lb-Y розово-оранжевый, Lb-Z яркооранжевый. Этим комплексам мы дали названия Lb-Y и Lb-Z, в соответствии с традицией:

название Lb-Х было ранее дано Эпплби комплексу легоглобина с никотиновой кислотой до определения структуры лиганда (Appleby et al., 1973).

Как показано на рисунке 6, спектры поглощения восстановленных комплексов Lb-Y и Lb-Z являются классическими спектрами гемохромов с характерными максимумами поглощения в полосах и. При этом спектр Lb-Y представляет собой двойной гемохромоген, с расщеплением в полосах (523, 532 нм) и (552, 560 нм).

0,0,А B 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,09 0,0,0,0,0,0,490 510 530 550 0,0,0,490 510 530 550 0,0,0,0,0,0,380 430 480 530 580 630 380 430 480 530 580 630 нм нм Рис. 6. Спектры поглощения восстановленного легоглобина сои, выделенного из клеток E. coli, с лигандами Y (А) и Z (B).

Поэтому мы предполагаем, что лиганд Y структурно отличается от лиганда Z и размещение лиганда Y в гемовой полости происходит с пространственными затруднениями.

При выделении легоглобина из клубеньков гороха мы также получили Lb, частично связанный с лигандом, который мы обозначили как Y’. Спектры Lb(II) –Y’, Lb(II) –Y и Lb(II) -Z по некоторым параметрам были подобны спектрам цитохромов группы b.

2.2. Природа лигандов Y, Y’и Z Для выяснения природы лигандов, модифицирующих легоглобин in vivo, эти вещества были нами выделены и охарактеризованы. Из сравнения спектров поглощения нативного и модифицированного легоглобинов видно, что имеются существенные отличия в их спектрах в УФ-области (рис. 7 А). Величина отношения поглощения при 275 нм к поглощению в полосе Соре для LbО2 А275/А411= 0,51, что ~ в 20 раз меньше, чем для Lb-Z А А (А275/А412 =12±3) (рис. 8 А). Известно, что поглощение при 250-280 нм обусловлено апобелковым компонентом молекулы и осуществляется хромофорными группами остатков ароматических и серосодержащих аминокислот. Спектры оптического поглощения очищенных лигандов имеют максимум в диапазоне 205-210 нм, плечо при 240-290 нм и плато постепенного снижения оптической плотности до 390 нм (рис. 7 B). Увеличение поглощения в УФ области модифицированных легоглобинов обусловлено, вероятно, наличием большого числа ароматических соединений. При этом спектры флуоресценции (возб.= 320 нм) модифицированных Lb имели четко выраженный максимум в видимой области.

А B 1,1,1,Лиганд Y' 0,Лиганд Y 0,Лиганд Z 0,0,0,Lb(III)-Z 0, 0,oxyLb 0,190 240 290 340 390 440 240 290 340 390 440 490 540 нм нм Рис. 7. А. Оптические спектры Lbа сои: LbO2 и Lb-Z. B. Оптические спектры лигандов, отделенных от Lbа сои (Y, Z) и Lb гороха (Y’).

На рис. 8 приведены инфракрасные спектры исследованных веществ. Как видно из рисунка, спектры трех лигандов довольно сильно отличаются, что является прямым указанием на то, что это структурно разные вещества. Анализ ИК-спектров лигандов Y и Y’ показал, что широкая полоса с плечами в области 3800-3200 см-1 обусловлена поглощением ОН-групп, а сложные полосы в интервале 1200-1030 см-1, относятся к валентным колебаниям эфирной и гидроксильной групп. Полосы в области 1720 (C=O) отсутствуют. Такое соотношение полос присуще такому классу соединений, как углеводы (Наканиси, 1965). Что касается спектра лиганда Z, то две полосы в области 1300-1100 см-1 и отсутствие полос в области 2950-2850 см-1 указывают на наличие валентных колебаний C-С. Отсутствие полос в интервале 3800-3200 см-1 в спектре лиганда Z, в отличие от спектров лигандов Y и Y’, также свидетельствует о том, что это структурно разные вещества.

А А Полученные результаты вместе с данными литературы позволили нам Поглощение 3.Лиганд Z предположить, что в качестве 2.модифицирующих агентов легоглобина 2.1.5 1296 выступают продукты гликоокисления.

1.Термин «продукты гликоокисления» был 0.введен для характеристики продуктов, 3.Лиганд Y 2.5 образуемых в результате комбинации 1074 2.реакций гликозилирования и окисления.

1.Некоторые продукты гликоокисления 1.могут образовываться не только из 0.3.углеводов, но также из других Лиганд Y' 2.предшественников, например из 1112 2.триозофосфатов, продуктов анаэробного 1.1.0 метаболизма, а также из липидов (Thorpe, 0.Baynes, 2003).

1000 2000 3000 Длина волны, см-Рис. 8. ИК-спектры лигандов, выделенных из Lba сои (Y и Z) и Lb гороха (Y’) Известно, что активные формы кислорода и азота катализируют химическую модификацию белков в реакции Майларда in vivo (Thorpe, Baynes, 2003). Классическая реакция Майларда это взаимодействие альдегидной группы углевода с аминогруппой аминокислоты. В результате этой реакции образуются короткие фрагменты сахара, а также химически реактивные интермедиаты: глиоксаль и метилглиоксаль.

Накопление -кетоальдегидов (глиоксаля, метилглиоксаля и 3-дезоксиглюкозонов), образующихся в результате автоокисления глюкозы, приводит к так называемому «карбонильному стрессу». Глиоксаль и метилглиоксаль могут взаимодействовать с остатками лизина и аргинина белка с образованием широкого спектра связанных с белком продуктов гликоокисления (Thorpe, Baynes, 2003). Конечные продукты гликоокисления могут иметь различную химическую структуру. Приведем формулы некоторых таких веществ:

A B C CH2OH HOCH -LysHO N HOCH HO N -LysCH2 O HO N -LysN N HN N NH HN -Arg-Arg весперлизины 3-деоксиглюкозон-Arg-имидазолон глюкозепан Известно, что в наибольшей степени в молекуле белка модификации подвержены остатки лизина, аргинина и цистеина. При этом в молекулах различных легоглобинов содержится достаточно большое количество лизинов. Также известно, что модификация остатков лизина в белках ускоряется, если они примыкают к основным аминокислотным остаткам (Thorpe, Baynes, 2003). В молекуле Lba сои содержится 7 таких пар: 4 Lys-Glu, Lys-Asp и одна Lys-Lys (Jones et al., 1998).

Следует отметить еще одну особенность строения легоглобинов наличие лизина в гемовом кармане. Этот лизин расположен в паре с глутаминовой кислотой и, может быть подвержен модификации углеводами с образованием гетероциклических соединений, которые образуют шестую координационную связь с железом гема, что видно по гемохромному типу спектра модифицированного Lb.

2.3. Взаимодействие метилглиоксаля с гемопротеидами Предположение, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда, мы проверяли, используя модельную систему, содержащую гемопротеид и метилглиоксаль (MG). Степень модификации белков определяли по изменению интенсивности флуоресценции после отделения несвязавшихся веществ диализом.

Использование метилглиоксаля в качестве модифицирующего агента обусловлено тем, что это вещество является наиболее активным карбонильным соединением, в основном взаимодействующим с остатками лизина. В последнее время MG рассматривают как универсальный медиатор образования конечных продуктов гликоокисления.

Из литературы известно, что при окислительном гликозилировании белков происходит образование конечных флуоресцирующих продуктов, имеющих желтую и коричневую окраску. Желтые пигменты обладают интенсивной флуоресценцией в области 398 нм при длине волны возбуждения 320 нм и охарактеризованы как имидазолоны (Lo et al., 1994; Yim et al., 1995).

Уже в первые часы инкубации гемопротеидов с MG мы наблюдали появление желтых флуоресцирующих продуктов, причем их концентрация возрастала со временем (рис. 9).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»