WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Космачевская Ольга Владимировна Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант:

Доктор биологических наук А.Ф. Топунов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.С. Капрельянц, Доктор биологических наук В.П. Реутов,

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Защита диссертации состоится 27 мая 2008 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

За последние 20 лет в области изучения гемоглобинов в связи с открытием новых представителей этого суперсемейства белков произошел переворот. Изучение новых гемоглобинов привело к выяснению важности таких функций этих белков, как детоксикация и детекция NO, которые, как полагают многие ученые, являются первичными функциями гемоглобинов. В свете этих данных возникла необходимость изучения альтернативных функций и легоглобина – растительного гемоглобина бобовых, функционирование которого, по-видимому, не ограничивается только переносом кислорода к микросимбионту симбиотической азотфиксирующей системы. Также очень важным является изучение физиологических внешних лигандов гемоглобина, модулирующих его активность по отношению к активным формам кислорода и азота.

Цель и задачи работы. Целью работы было исследование влияния физиологических лигандов на функционирование легоглобина, в том числе и при посттрансляционной модификации в условиях in vivo и in vitro.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние редокс-медиаторов на рост клеток Escherichia coli, содержащих ген легоглобина, и синтез Lba клетками E. coli;

2) Определить характер соединений, модифицирующих легоглобин;

3) Изучить влияние модификации легоглобина на его функционирование, в том числе в условиях окислительного и нитрозативного стресса;

4) Изучить влияние динитрозильных комплексов железа, связанных с гемоглобином, на степень окислительной модификации гемоглобина.

Научная новизна. Показано, что легоглобин в системе in vivo может образовывать нитрозильные комплексы с гемовым и негемовым железом. Впервые показано, что динитрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, защищают его от окислительной деструкции. Также впервые установлено, что легоглобин, выделенный из клубеньков, содержит долю гликозилированного Lb, устойчивого к действию гидропероксидов. Продукты гликоокисления, связанные с белками, могут функционировать как кофакторы в окислительно-востановительных реакциях, причем реакция взаимодействия модифицированного легоглобина с H2O2 при определенных концентрациях субстрата протекает в автоколебательном режиме. Показано, что ранее обнаруженные в клубеньках бобовых низкомолекулярные восстановители (B и R), скорее всего, представляют собой продукты гликозилирования аминокислот и пептидов.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные могут помочь выяснению механизмов ответа азотфиксирующей системы на окислительный, нитрозативный и карбонильный стресс, что важно для селекции бобовых растений, устойчивым к внешним воздействиям, а также при их выращивании в неблагоприятных условиях. Гликозилированный легоглобин может быть использован как маркер физиологического состояния корневых клубеньков. Разработанный метод определения концентрации гемоглобинподобных белков может быть применен для изучения гемоглобинов разного происхождения, в том числе в гетерогенных смесях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 193 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 9 таблиц. Список цитируемой литературы включает 345 наименований, из них 290 работ зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:

Всероссийской конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков».

(Ярославль, 2003), Межвузовской научной конференции «Биология растений в новом тысячелетии» (Калининград, 2007), XIV и XV международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», сателлитный симпозиум «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Гурзуф, Украина, 2006, 2007).

Доклад на XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» был отмечен как лучший доклад молодого ученого.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (4 статьи, 5 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный и бактериальный материал, использованный в работе. Были использованы растения гороха посевного (Pisum sativum L.) сорта Sparkle и бобов (Faba bona Medik) сорта «Русские черные», выращенные в полевых условиях Московской области.

Растения были инокулированы клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv.

Viciae, штамм CIAM 1026 из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург). Клубеньки собирали на стадии бутонизации начала цветения.

В работе были использованы клетки Escherichia coli штамма TB-1, модифицированного плазмидой pEMBL18+::SyLba со встроенным геном Lba сои, полученного сотрудниками Автономного университета штата Морелос (Мексика) и Университета штата Небраска (США).

Выращивание и обработка клеток редокс-медиаторами. Маточную культуру (15 ч роста) использовали для заcева серии колб объемом 350 мл, содержащих 60 мл жидкой среды LB с ампициллином (50 мкг/мл – в случае модифицированного штамма) до А600 = 0,0,03. Режим аэрации меняли путем варьирования объема питательной среды в колбах.

Выращивание клеток осуществляли при 37 оС на термошейкере фирмы «Биоком» (Россия) с частотой орбитального движения 200 об/мин. Гидропероксид трет-бутила (t-BOOH), бензилвиологен (Bv) и S-нитрозоглютатион (GSNO) в различных концентрациях вносили в среду через 3 ч после засева (А600 = 0,120,15). Концентрацию клеток в культуре измеряли через каждые 2 ч по величине оптической плотности при 600 нм в 0,1 см кювете.

Получение различных форм гемопротеидов. Окисленные гемопротеиды получали их окислением феррицианидом калия. Для получения восстановленных гемопротеидов белок восстанавливали дитионитом натрия. Нитрозилированный Lb получали обработкой белка GSNO. Образование соответствующих форм гемоглобинов контролировали спектрофотометрически, используя следующие коэффициенты миллимолярной экстинкции (мМ-1·см-1): оксиLb 411=125, 541= 15,0, 575=14,8 (Herold, 2005), дезоксиLb 427=111, 554,5=13,3, метLb 403=157, 626=4,92 (Jones et al., 1998), нитрозилLb 418=130, 545=12,6, 575=13,0 (Ernesto, Di Iorio, 1981).

Определение концентрации гемопротеидов. Для образца гемопротеида в щелочном растворе пиридина определяли разницу: D = (D556red – D oxi ) – (D red – D oxi) 556 539 (Riggs, 1981). Концентрацию гемовых белков рассчитывали, используя значение коэффициента миллимолярной экстинкции E = 4,3 ммоль-1см-1, определенное в нашей работе для данного D. Концентрацию Lb в смесях, содержащих примеси, определяли по разработанному нами методу (Космачевская, Топунов, 2007).

Определение общего белка. Количество общего белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).

Электрофорез белков в ПААГ. Денатурирующий электрофорез Hb проводили в блоках 15% ПААГ размером 150*150*1 мл по методу Лэммли (Laemmli, 1970) с модификациями, используя прибор для вертикального электорофореза серии VE («Хеликон», Россия). Реакционная смесь содержала 25 мкл Hb, Hb-ДНКЖ или Hb с ДНКЖ после распада в 0,2 М K-Na фосфатном буфере (рН 7,4) и 5 мМ DTPA. H2O2 добавляли к смеси до концентраций 400, 800 и 1600 мкМ. Концентрация Hb во всех случаях была 560 мкМ (HbДНКЖ —780 мкМ). Конечный объем смеси составлял 45 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. ДНКЖ после распада были получены при инкубации в течении 5 ч при комнатной температуре.

Электрофорез белков легоглобинсодержащей фракции клеточного экстракта E. coli в неденатурирующих условиях проводили в 15% ПААГ без SDS. Буфер для образцов был приготовлен на основе 125 мМ Tris -HCl буфера (рН 6,8) с 0,1 М феррицианидом калия и 15% глицерином. Белок на гель наносили в количестве, содержащем 100 мкг белка на дорожку.

Выделение и очистка лигандов Y’, Y, Z. Лиганды (Y’, Y, Z) отделяли от легоглобина, используя модифицированный метод (Fluckiger et al., 1997), суть которого заключается в мягком кислотном гидролизе кетоаминной связи в гликозилированном Lb.

Получение гликозилированных гемопротеидов. К растворам гемопротеидов в концентрации 0,3 мМ в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7, 4), содержавшем 0,02% азида натрия, предварительно деаэрированных продувкой аргоном, добавляли метилглиоксаль до концентрации 5,5 мМ. Растворы инкубировали в темноте при 30 оС.

Определение пероксидазной активности. При измерении пероксидазной активности в качестве субстрата использовали пероксид водорода, уменьшение концентрации которого регистрировали спектрофотометрически при 240 нм (240 = 43,6 M-1см-1) (Arnao et al., 1990). Для определения кинетических параметров использовали очищенные препараты легоглобина в 0,02 М К-фосфатном буфере (рН 7,2), измерения проводили не менее, чем в трех повторностях, при 20 оС.

Регистрация ДНКЖ в клетках и модельных системах. После инкубации с GSNO (6,5 мМ) и t-BOOH клетки концентрировали в 75 раз, помещали в пластиковые трубки и быстро замораживали при температуре жидкого азота (-170 °С). Измерения проводили также при температуре -170°С. Количество ДНКЖ оценивали по интенсивности характерного сигнала ЭПР парамагнитной формы комплекса (g = 2,034). ЭПР спектры снимали на спектрометре X-диапазона («Varian», США) при следующих параметрах измерения: частота модуляции 100 кГц, мощность микроволнового излучения 10 мВ, частота микроволнового излучения 9,15 ГГц и амплитуда модуляции 0,2 или 0,1 мТл для спиновых аддуктов ДНКЖ или DEPMPO соответственно.

Регистрация спиновых аддуктов DEPMPO со свободными радикалами.

Исследование генерации свободных радикалов при взаимодействии гемоглобина с гидропероксидом трет-бутила проводили с использованием спиновой ловушки DEPMPO в среде, содержавшей: 150 мМ K-Na фосфатный буфер (pH 7,4); 40 мM DEPMPO; 1,6 мМ ДТПА; 235 мкM гемоглобина и гидропероксид трет-бутила в концентрациях 0,4 и 0,8 мМ.

В экспериментах с Hb-ДНКЖ их концентрация составляла 340 мкM.

Стандартный ЭПР спектр аддукта DEPMPO с тиильным радикалом был зарегистрирован в смеси, содержавшей 0,5 мM пероксида водорода, 0,8 мМ восстановленного глютатиона и пероксидазу хрена (0,2 мг/мл). В аналогичной системе, содержавшей вместо глютатиона 2 мМ тирозина, был получен аддукт DEPMPO с тирозиновым радикалом. Спектры аддуктов DEPMPO с алкокси- и алкилпероксильными радикалами были зарегистрированы при взаимодействии 1,4 мM гидропероксида третбутила с 0,45 мM гемином. Во всех экспериментах реакционная среда содержала 0,15 M KNa-фосфатный буфер (pH 7,4), 40 мM DEPMPO, 1,6 мM ДТПА. Спектры ЭПР записывались через 3 мин после смешивания всех компонентов реакционной среды.

Регистрация спектров поглощения. Спектры поглощения растворов белков, лигандов и целых клеток записывали на спектрофотометре “Beckman Coulter DU 650” (США) в 1 см кювете. Запись спектров осуществляли при комнатной температуре со скоростью 600 нм/мин.

Спектрофлуориметрия. Регистрацию спектров флуоресценции проводили при 20 оС в 0,02 М К-фосфатном буфере, (рН 7,2) на спектрофлуориметре “Shimadzu RF-5301 PC” (Япония). Длина волны возбуждения составляла 320 нм.

ИК-спектроскопия. ИК-спектры образцов снимали на Фурье-спектрометре “AFS66/V/S” фирмы “Brucker” (Германия). Исследуемый материал прессовали в виде таблеток с KBr. Спектры снимали в области 400 – 4000 см-1. Разрешающая способность составляла 1 см-1.

КД-спектроскопия. Спектры кругового дихроизма соевого Lba снимали на спектрометре “Chirascan” фирмы “Applied Photophysics” (США) в 0,2 см кварцевой кювете при температуре 5 °С, со скоростью сканирования 0,6 нм/с.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Функционирование легоглобина в системе E. coli В качестве модели для изучения функционирования легоглобина в условиях окислительного стресса использовали клетки E. coli с встроенным геном легоглобина сои.

Для создания в клетках условий окислительного и нитрозативного стрессов использовали следующие вещества: гидропероксид трет-бутила, бензилвиологен и S-нитрозоглутатион.

Исследования были проведены на трех типах культур клеток: не синтезирующие легоглобин (С-Lb) 0,08 мкг гема/мг белка, синтезирующие Lb в малых количествах (С±Lb) 0,15 мкг гема/мг белка, и активно синтезирующие Lb (С+Lb) 0,45 мкг гема/мг бела.

В наших экспериментах рост культур С-Lb, С±Lb и С+Lb в середине логарифмической фазы роста (7 ч) подавлялся гидропероксидом трет-бутила в равной степени (~ 45%) (рис.

1). Культуры С+Lb и С±Lb обнаруживали большую чувствительность к t-BOOH уровень роста С+Lb и С±Lb к 24 ч по сравнению с контролем составлял 88% и 60% соответственно. В случае С-Lb рост достигал уровня контроля в стационарной фазе. Этот факт согласуется с результатами, ранее полученными в нашей лаборатории (Петрова, 2002) в аналогичных опытах с использованием штамма E. coli BL21(DE3)pLysS с встроенным в плазмиду pET-3a геном LbII люпина.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»