WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Рис. 9. Оценка связывания белка Q-M2B с различными иммуноглобулинами. В качестве субстратов использовали очищенные препараты IgA2, IgG, IgM человека и Ig кролика.

Кривая «IgA2+конкурент» получена при раститровке IgA2 в буфере, представляющем собой разведенную 1:1000 плазму здорового донора.

Ожидалось, что при устойчивом образовании комплексов НСД-IgAприсутствие конкурента не повлияет на вид кривой титрования. Результаты эксперимента, отражающие взаимодействие белка с различными Ig, представлены на рис. 9, где показаны графические зависимости оптической плотности при длине волны A492 (ось Y) от концентрации субстрата в точке титрования (ось X).

Как видно из представленных зависимостей, сигнал при взаимодействии Q-M2B с IgG, IgM и Ig кролика можно расценивать как фоновый по сравнению с сигналом от IgA2. Идентичность кривых при взаимодействии белка с IgA2, полученных в присутствии и в отсутствии конкурента, позволяет сделать вывод о том, что разнообразные белки плазмы крови не оказывают влияния на взаимодействие домена со специфическим лигандом.

2.4.4. Связывание с S-IgA человека. Как известно из литературы, IgA1протеза менингококка расщепляет не только сывороточные, но и секреторные IgA1. Так как полученный нами НСД устойчиво связывается с сывороточными IgA с достаточно высокой аффинностью, было принято решение о проверке подобного взаимодействия с секреторными иммуноглобулинами. В качестве источника S-IgA были использованы частично обогащенные препараты слюны четырех здоровых доноров (см.

Методы). Состав белков этих препаратов анализировали с помощью ДСНПААГ (рис. 10). В качестве стандарта сравнения наносили очищенный коммерческий препарат секреторных IgA.

1 2 3 4 5 Рис. 10. Электрофореграмма в 12.5% денатурирующем ПААГ, окрашенная Кумасси-R250. На дорожки геля нанесены обогащенные S-IgA препараты слюны:

1. донора №1; 5. контрольный препарат 2. донора №2; (очищенные S- IgA);

3. донора №3; 6. донора №4.

4. стандарт молекулярной массы (116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4 кДа);

Концентрация общего белка во всех препаратах была унифицирована, после чего они использовались в качестве источника субстрата для связывания с Q-M2B при тИФА согласно стандартной схеме, описанной выше. Образование комплексов НСД – S-IgA визуализировали с помощью специфичного антивидового конъюгата pGAH-Iaa. Результаты эксперимента представлены на рис. 11, где показаны графические зависимости оптической плотности при длине волны А492 от концентрации субстрата в точке титрования.

Рис. 11. Оценка связывания белка Q-M2B с S-IgA. Использованные для связывания с Q-M2B препараты слюны, обогащенные S-IgA выровнены общего белка по концентрации между собой и коммерческими S-IgA, которые применяли в качестве контроля.

Из представленных графических зависимостей видно, что специфический сигнал связывания с Q-M2B наблюдается для трех препаратов: доноры №1, 2, 3. Только S-IgA из слюны донора №4 оказались нереакционноспособными. С другой стороны, следует заметить, что характер кривых отличен от полученной при реакции с чистыми IgA2. Причинами этого могут являться как наличие примесных веществ в препарате белков слюны, так и их более низкая естественная аффинность к НСД IgA1протеазы по сравнению с сывороточными IgA.

3. Выводы 1. В соответствии с выдвинутой нами гипотезой о двухдоменной организации IgA1-специфичной протеазы N. meningitidis впервые получены рекомбинантные продуценты, позволяющие синтезировать в виде телец включения в E. coli изолированные каталитический и некаталитический субстрат-связывающий домены.

2. Предложена методика очистки и ренатурации, позволившая получить функционально активные рекомбинантные производные IgA1-протеазы N.meningitidis.

3. Показано наличие протеолитической активности у каталитического домена IgA1-протеазы менингококка в отношении IgА1 человека.

4. Показано высокоаффинное связывание некаталитического субстратсвязывающего домена IgA1-протеазы менингококка с сывороточными и секреторными IgA человека. Обнаружена способность домена распознавать IgA2 человека, причем с бльшей аффинностью, чем IgA1.

Список публикаций по теме диссертации 1. Казеева Т.Н., Шевелев А.Б., Неизвестные функции иммуноглобулинов А, Биохимия, 2007, №5, стр. 485-2. Хоменков В.Г., Казеева Т.Н., Шевелев Б.И., Барграссер В.П, Скоблов М.Ю., Шевелев А.Б., Клонирование и экспрессия генов IgA-специфичных протеаз Neisseria meningitidis, Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2007, №1, стр. 30-3. Khamiankou V., Kazeeva T., Shevelev A., Expression of IgA-specific endopeptidases from Neisseria meningitidis in E. coli. 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases ICC, Munich, Germany, 31 Mar - 04 Apr 2007.

Abstract

number: 1733_4. Казеева Т.Н., Хоменков В.Г., Керученько Я.С., Шевелев Б.И., Шевелев А.Б., Доменная организация IgA-специфичной протеазы менингококка и подходы к разработке лекарства от инфекционного менингита, Юбилейные Научные Чтения, посвященные 110-летию со дня рождения проф. Н.А.

Преображенского, Тезисы докладов, Москва, 2006, стр. 30.

5. Kazeeva T.N., Khomenkov V.G., Kuznetsova T.V., Shevelev A.B., Study of IgA-specific endopeptidases from Neisseria meningitidis and their genes.

International conference Biocatalysis – 2005: fundamentals and applications, St.Petersburg – Kizhiy – Valaam, Book of abstract, 2005, St.Petersburg, p.90.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»