WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Рис. 2. Реакция сульфитолиза Данный подход позволяет повысить степень извлечения белка, т.к.

наряду с обработкой мочевиной происходит химическая реакция разрыва дисульфидных связей; образующийся при этом S-сульфонат обладает большей растворимостью и стабильностью по сравнению с полностью восстановленным белковым производным, так как не вступает в спонтанную реакцию с кислородом воздуха; в ходе ренатурации сульфонатные группы могут быть удалены за счет реакции с сульфгидрильным воccтанавливающим агентом.

Сульфирование телец включения Q-M2B проводили как указано в Материалах и методах. В отличие от Q-M2B разрушение дисульфидных связей белка QG-A2C проводили традиционным способом, используя органические меркаптаны для восстановления дисульфидных связей.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что обязательным условием очистки рекомбинантного белка, обеспечивающим высокий выход и воспроизводимость последующей ренатурации, является удаление примесей нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с помощью хроматографической очистки в денатурирующих условиях, что обеспечивает высокий выход и воспроизводимость последующей ренатурации. В качестве сорбента в ходе хроматографии использовали анионообменную смолу DEAE Toyo Pearl (Toyo Soda Corporation), уравновешенную буфером Трис-HCl (рН 8.8 или 8.2). Элюцию связавшегося белка Q-M2B (либо QG-A2C) восходящим градиентом NaCl проводили общим объемом буфера 200 мл, разбивая элюат на 20 фракций по 10 мл. В типичных экспериментах целевой продукт находился в нескольких фракциях и суммарный выход белка составлял 50100 мг. Содержание целевого белка в отобранных препаратах определяли визуально с помощью ДСН-ПААГ. Фракции с наибольшим содержанием продукта (не менее 80%) объединяли и использовали в качестве исходного материала для отработки методики ренатурации.

Полученные после хроматографии растворы рекомбинантных белков QG-А2С в восстановленной форме и Q-M2B в форме сульфонатного производного с концентрацией белка 2.5 мг/мл в буфере с содержанием мочевины 4 М использовали в качестве исходного материала для ренатурации. В ходе подбора оптимального состава ренатурационного буфера каждую аликвоту раствора белка разбавляли в 2 раза одним из предложенных буферов, содержащих свежеприготовленный ДТТ в количестве 2 мМ, который использовали в качестве восстановителя. Целью эксперимента являлся подбор условий, при которых потери белка за счет агрегации минимальны. Для оценки выхода растворимого белка использовали метод Лоури и, дополнительно, электрофорез в ДСН-ПААГ.

Исходя из полученных данных, была отобрана серия буферов - №1, №3, №9, №11, №13, №15, которые обеспечивали высокий выход водорастворимого белка. В качестве примера приведена электрофореграмма с белками, растворенными в буфере №9 (рис. 3).

Q-M2B кДа 66.QG-A2C 18.1 2 Рис. 3. Электрофореграмма в 12.5% денатурирующем ПААГ, окрашенная Кумасси-R250. На дорожки геля нанесены:

1. стандарт молекулярной массы;

2. ренатурированный Q-M2B;

3. ренатурированный QG-A2C.

На основании анализа результатов ренатурации для дальнейшего исследования был выбран препарат QG-A2C, полученный с помощью буфера №9.

2.3. Изучение протеолитической активности белка QG-A2C в отношении IgA1 человека. Получение белка QG-A2C в ренатурированном состоянии позволило перейти к экспериментам по изучению его протеолитической активности. Поскольку для оценки активности IgA1протеазы до настоящего времени не разработано синтетических хромогенных производных пептидов, в качестве модели был выбран естественный субстрат – IgA1 человека. Предполагалось, что специфичность их расщепления рекомбинантным белком QG-A2C может претерпеть бльшие или меньшие изменения по сравнению с полноразмерным ферментом.

Исходя из этого, в ходе эксперимента по тестированию белка мы стремилась использовать методы, позволяющие не только визуализировать факт наличия у полученного продукта протеолитической активности, но и с максимальной точностью установить точки атаки субстрата, что позволило бы судить об изменении его субстратной специфичности по сравнению с природным ферментом. В качестве субстрата использовали плазму больного миеломой, обогащенную IgA1. Ферментативную реакцию QG-A2C с IgА1 человека проводили в объеме 300 мкл в буфере PBS (pH 7.4). Контролем служила культуральная жидкость штамма А208 N. meningitidis, содержание фермента в которой было неизвестно. Для более полного анализа работы рекомбинантного фермента продукты расщепления разделяли в ПААГ двумя способами: с восстановлением и без восстановления дисульфидных связей в субстрате.

Электрофорез в восстанавливающих условиях проводили с использованием в качестве восстановителя -меркаптоэтанола. После переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану визуализировали продукты с помощью Вестерн-блоттинга согласно схеме, описанной в Материалах и методах. Итоги эксперимента представлены на рис. 4.

Рис. 4. Анализ продуктов расщепления IgA1 белком QG-A2C. Разделение в 12.5% ПААГ в присутствии восстановителя. Мембрана окрашена вторичными антителами против -цепей Ig человека, конъюгированными с пероксидазой. На дорожки геля нанесены:1) маркер молекулярной массы; 2) нативный IgA1 (в составе плазмы больного миеломой); 3) IgA1 человека после расщепления QG-A2C; 4) IgA1 человека после расщепления ферментами культуральной жидкости N. meningitidis А208.

На основании полученных данных можно заключить, что при расщеплении IgA1 рекомбинантным ферментом и природной протеазой, наблюдается образование сходных фрагментов, предположительно соответствующих Fc-фрагменту IgA1 человека с молекулярной массой около 30 кДа. Контроль интактных IgA1 при окрашивании конъюгатом визуализируется полосой около 47 кДа, что соответствует ожидаемой массе тяжелой цепи () с учетом гликозилирования. Эксперимент не выявил дополнительных точек расщепления -цепи IgA несмотря на то, что время проведения реакции позволило достигнуть полного исчерпания субстрата.

Конкуренция со стороны неспецифических белков плазмы человека не привела к подавлению активности рекомбинантного белка.

Для изучения структуры Fab-фрагментов, образующихся в ходе описанной протеолитической реакции белка Q-M2B с IgA1 человека была применена альтернативная схема визуализации продуктов: подготовку образцов перед разделением в ДСН-ПААГ проводили в невосстанавливающих условиях, а специфическое окрашивание перенесенных на мембрану фрагментов IgA1 визуализировали с использованием вторичных антител против /-цепей человека, конъюгированных с пероксидазой (рис. 5).

Рис. 5. Анализ продуктов расщепления IgA1 белком QG-A2C.

Разделение в 12.5% ПААГ в отсутствие восстановителя. Мембрана окрашена вторичными антителами против /-цепей Ig человека. На дорожки геля нанесены: 1) стандарт молекулярной массы; 2) субстрат, расщепленный QG-A2C; 3) субстрат, расщепленный ферментами в составе культуральной жидкости N. meningitidis A208; 4) нативные IgA1 (в составе плазмы больного миеломой).

На основании анализа результатов экспериментов, проведенных по двум различным схемам, можно высказать несколько предположений относительно взаимодействия КТД c IgA1 человека:

1. Активность КТД уступает активности природного фермента, поскольку на рис. 5 можно видеть значительное количество нерасщепленных высокомолекулярных Ig, идущих в виде двух или более полос с различающейся молекулярной массой.

2. При обработке субстрата ферментом культуральной жидкости менингококка единственным иммуноположительным продуктом оказывается полоса размером около 50 кДа, предположительно соответствующая моновалентному Fab-фрагменту (VH+CHl-фрагмент -цепи соединенный дисульфидной связью с легкой цепью в составе VL+CL.доменов). Напротив, масса основного продукта расщепления QG-A2C около 105 кДа, что по размеру может соответствовать бивалентному Fab-фрагменту в составе двух VH+CHl-фрагментов -цепи соединенных между собой дисульфидной связью, каждый из которых несет связанную легкую цепь в составе VL+CL.доменов. Такой результат может быть достигнут при небольшом смещении сайта расщепления -цепи в сторону С-конца молекулы иммуноглобулина, поскольку дисульфидная связь, соединяющая -цепи находится в непосредственной близости к шарнирной области.

Таким образом, проведенные эксперименты показали наличие протеолитической активности у белка QG-A2C, что подтверждает гипотезу о локализации протеолитического домена в N-концевой части последовательности IgA1-протеазы менингококка. Результаты, приведенные на рис. 5, можно объяснить, предположив, что для изолированного КТД сайт атаки IgA1 несколько смещен по сравнению с природным ферментом, хотя и остается в пределах главной шарнирной области IgA1 или в непосредственной близости от нее.

Предлагаемая модель расщепления IgA1 белком QG-A2C представлена на рис. 6.

Шарнирный регион IgAДисульфидная связь S S Сайт атаки в молекуле IgA1 Предполагаемый сайт атаки в природным ферментом из молекуле IgA1 рекомбинантным QGкультуральной жидкости A2C, расположенный к С-концу от менингококка, расположенный в дисульфидной связи, соединяющей шарнирном регионе. Расщепление цепи. Расщепление приводит к приводит к образованию образованию бивалентного Fabмоновалентного Fab-фрагмента фрагмента Рис. 6. Расположение сайтов расщепления в молекуле IgA1 природной IgA1-протеазой менингококка и белком QG-A2C 2.4. Изучение IgA-связывающей активности белка Q-M2B.

2.4.1. Оценка выхода ренатурации препарата Q-M2B методом тИФА. В отличие от ренатурированного белка QG-A2C, у белка Q-M2B не предполагалось наличие протеолитической активности в отношении IgAчеловека, которую можно было бы сравнить с активностью полноразмерного природного фермента и сделать вывод о функционировании полученного препарата. С целью исключения некорректных результатов при проведении экспериментов по изучению предполагаемой способности Q-M2B к аффинному связыванию с IgA человека, было принято решение о тестировании выхода нативного продукта. При проведении процедуры ренатурации необходимо учитывать, что водорастворимая фракция полученного препарата не всегда представлена полностью нативным белком, обладающим биологической активностью. Это связано с возможностью аберрантного фолдинга, дающего неактивный, но растворимый и устойчивый продукт. В связи с этим для выбора образца с наибольшим выходом нативного Q-M2B был проведен тИФА, где активность белка определялась как способность к специфичному связыванию IgA человека. Для проведения эксперимента использовали серию ранее выбранных ренатурированных препаратов Q-M2B. На рис. 7 представлены графические зависимости оптической плотности (ось Y) при длине волны 492 нм от концентрации IgA в точке титрования (ось X).

Рис. 7. Оценка эффективности ренатурации Q-M2B методом тИФА.

Показано связывание белка Q-M2B с IgA человека в зависимости от выхода нативного продукта при ренатурации в различных буферах.

Анализируя полученные данные можно сделать вывод, что наибольший выход нативного белка, специфично связывающего IgA человека, достигается при использовании буферов №9 и №15. Так как данные буфера оказались одинаково эффективны, было принято решение о дальнейшем использовании только буфера №9.

2.4.2. Изучение связывающей способности белка Q-M2B в отношении природного субстрата – IgA человека. Как описывалось ранее, белок Q-M2B представляет собой продукт экспрессии фрагмента гена IgAlспецифичной протеазы менингококка группы А, патогенного штамма М9.

Использованный для экспрессии фрагмент гена iga подобран таким образом, чтобы исключить из его состава предполагаемый каталитический (протеолитический) домен, располагающийся в N-концевой части полноразмерной IgAl-специфичной протеазы. Предполагалось, что естественной функцией некаталитического домена в составе протеазы является распознавание субстрата с целью своевременного раскрытия каталитического центра и предотвращения его конкурентного ингибирования неспецифическими пептидами. Поскольку естественным субстратом IgA1протеазы менингококка является IgAl человека, то в задачу входила экспериментальная проверка способности белка Q-M2B связывать IgA с высокой аффинностью. В качестве субстратов для связывания с Q-M2B мы использовали плазмы больных миеломой, обогащенные IgA1 или IgA2 с известной их концентрацией (20 мг/мл). Эксперимент был проведен согласно описанному в Материалах и методах тИФА. На рис. 8 приведены графические зависимости оптической плотности при длине волны 492 нм (ось Y) от концентрации субстрата в точке титрования (ось X).

Рис. 8. Оценка связывания Q-M2B с IgA1 и IgA2 в составе препаратов плазмы. На активированные ренатурированным в буфере №9 Q-M2B 8-ми луночные ряды подложки были нанесены препараты плазмы больных миеломой с определенной концентрацией IgA1 (либо IgA2) в каждой точке разведения.

Как видно из представленных зависимостей, полученный белок Q-M2B обладает достаточно высокой аффинностью к IgA человека, что позволяет говорить о подтверждении выдвинутой нами теории о функциональной роли С-концевого домена IgA1-протеазы менингококка. Однако достаточно неожиданным является тот факт, что аффинность по отношению к IgAзначительно выше, чем к природному субстрату протеазы менингококка – IgA1. Полученный результат, тем не менее, не противоречит описанным в литературе экспериментам по исследованию активности полноразмерной протеазы в присутствие различных субстратов. Так есть данные, что IgA1протезы ингибируются биологическими жидкостями, обогащенными IgA(Plaut, 1983). Таким образом, связывание IgA2 с ферментом, не приводящее к расщеплению субстрата, может рассматриваться в качестве природного механизма с определенной функцией. В частности можно предположить, что образование данных комплексов IgA2-протеаза in vivo может играть определенную роль в развитие менингококковой инфекции.

2.4.3. Изучение связывающей способности в отношении различных иммуноглобулинов. Проявление высокой связывающей активности белка QM2B в отношении IgA человека не исключает его взаимодействия с другими лигандами. Для проверки данного предположения был проведен тИФА согласно обычной схеме, где в качестве субстратов были выбраны очищенные препараты IgA2, IgG, IgM человека и иммуноглобулины кролика с известными концентрациями. Также был проведен тест на устойчивость связывающей способности Q-M2B к конкуренции со стороны различных белков плазмы крови человека, поскольку естественной средой при взаимодействии природной протеазы с IgA является именно эта биологическая жидкость. Разведенную 1:1000 плазму применяли в качестве буфера для нанесения IgA2.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»