WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

1.3.4. Подбор условий ренатурации белков методом разбавления. К аликвотам белка, очищенного хроматографией в денатурирующих условиях, с концентрацией 23 мг/мл, объемом 500 мкл каждая прибавляли равный объем одного из 15 буферов из панели, рекомендованных Athenaes Protein Refolding Manual. Непосредственно перед использованием в каждый из буферов добавляли свежеприготовленный раствор восстановителя - ДТТ или восстановленного глутатиона - до конечной концентрации 2 мМ.

Разбавленные таким образом аликвоты белка инкубировали в течение 18 ч при 4°С, после чего отделяли агрегировавший белок центрифугированием на настольной центрифуге при 8000 g в течение 20 мин. Выход ренатурации предварительно оценивали как долю белка, оставшегося в растворе по окончании описанной процедуры.

1.4. Изучение активности белка QG-A2C методом Вестернблоттинга. Электрофоретическому разделению в ПААГ подвергались аликвоты образцов общим объемом 300 мкл каждая, содержащие 40 мкг IgAв составе плазмы миеломного больного, 30 мкл ренатурированного белка QG-А2С (содержание общего белка 0.7 мкг) либо культуральной жидкости менингококка того же объема и 270 мкл PBS (10 мМ Na2HPО4, 150 мМ NaCl, pH 7.4). В качестве отрицательного контроля использовали необработанную ферментами плазму. Для проведения протеолитической реакции образцы инкубировали при 30°С в течение 24 часов, после чего вносили в каждую лунку ТХУ до конечной концентрации 7% с целью остановки реакции и осаждения белков. Для обессоливания сформировавшиеся осадки промывали 50% водным ацетоном.

Осажденные и высушенные образцы белков солюбилизировали в денатурирующих условиях в буфере Лэммли (100 мМ Трис-глицин, 1% ДСН, 0.01% бромфеноловый синий, рН 8.6), содержащем или не содержащем восстановитель (100 мМ -меркаптоэтанол). Для проведения одного электрофоретического теста использовали 1/5 объема реакционной смеси, описанной в предыдущем абзаце: содержание IgA без учета потерь - 8 мкг на одну дорожку.

Полусухой перенос разделенных в ПААГ рекомбинантных белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли в течение 2.5 ч при плотности тока 1.3 мА/см2 поверхности мембраны. Перенесенные на мембрану белки окрашивали в растворе 1% Ponceau S, приготовленного на 10% уксусной кислоте, в течение 1-3 мин при покачивании. Для удаления фона обесцвечивали мембрану, промывая ее в нескольких сменах воды;

расположение полос молекулярно-массового стандарта отмечали карандашом. Далее оставляли мембрану в растворе для блокирования неспецифической сорбции (1% БСА, приготовленный на PBS) при покачивании в течение 60 мин при 25°С. В случае электрофореза в восстанавливающих условиях визуализацию фрагментов IgA на мембране осуществляли при помощи антивидового пероксидазного конъюгата против -цепей Ig человека pGAH-Iaa (ЗАО «Имтек») в разведении 1:1000. При электрофорезе в невосстанавливающих условиях для визуализации ожидаемых Fab фрагментов IgA использовали вторичные антитела против /-цепей иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 (ЗАО «Амеркард»). Реакцию с вторичными антителами проводили в течение 1 часа при комнатной температуре.

Ферментативную реакцию на пероксидазу с образованием окрашенного нерастворимого продукта проводили в буфере PBS с использованием в качестве субстрата N,N’-диаминобензидина в концентрации 20 мкг/мл и H2Oв концентрации 0.03%. Реакцию останавливали, перенося мембрану в раствор 10% уксусной кислоты.

1.5. Получение препарата S-IgA. В качестве источника S-IgA служили образцы слюны четырех здоровых доноров по 2.5 мл каждого. Собранный материал разбавляли в два раза PBS, центрифугировали при 12 000g в течение 30 мин. Супернатант собирали и осаждали IgA высаливанием (NH4)2SO4, доводя его концентрацию до 50% от насыщения. Осадок собирали центрифугированием и растворяли в 0.5 мл PBS. Полученный препарат анализировали с помощью ДСН-ПААГ. Концентрацию белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури с бицинхониновым реагентом.

1.6. Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) использовался для исследования Ig-связывающей способности белка Q-M2B:

1) при оценке эффективности его ренатурации и 2) для определения его сродства к различным природным белкам-лигандам. В качестве источника Ig служили плазмы больных миеломой, содержащие моноклональные IgA1 или IgA2; суммарные иммуноглобулины плазмы кролика; частично обогащенные S-IgA препараты слюны человека и очищенные до гомогенности IgA2, IgG и IgM человека, предоставленные ЗАО «Имтек».

Ренатурированный Q-M2B сорбировали на полистироловые 96луночные плоскодонные планшеты (Costar) средней сорбционной емкости.

Для этого раствор белка с концентрацией 10 мкг/мл в буфере NCA (100 мМ карбонат-бикарбонат Na, pH 9.6) разносили в лунки по 100 мкл в каждую и инкубировали в течение 12 ч при +4С. Далее вносили раствор для блокирования неспецифической сорбции (1% БСА в буфере NCA) в количестве 100 мкл в каждую лунку и инкубировали 60 мин на шейкере Biosan при +20°С. Промывали лунки несколько раз PBSTw (10 мМ Na2HPО4, 150 мМ NaCl pH 7.4, 0.05% Твин-20). Для исследования связывающей способности Q-M2B в отношении выбранного лиганда изготавливали серию разведений препарата, содержащего данный лиганд, в буфере PBS в 7 лунках 8-луночного ряда планшета с сорбированным ранее Q-M2B. Концентрация общего белка в первой точке составляла 20 мг/мл, в последней – 0.027 мг/мл.

Титрование проводили с шагом 3 раза так, что в последнюю лунку каждого 8-луночного ряда лиганд не вносился, что позволяло определить фоновый сигнал, величина А492 которого вычиталась из абсолютных величин Аэкспериментальных точек.

В некоторых экспериментах наряду с источником Ig-лиганда в реакционную смесь вносили разведенную 1:1000 плазму здорового донора, белки которой служили в качестве конкурента при взаимодействии целевого субстрата с Q-M2B. В этом случае разведенная плазма заменяла буфер PBS и вносилась во все лунки с серийными разведениями Ig в одинаковой концентрации.

Для связывания лиганда с сорбированным белком Q-M2B планшет инкубировали 60 мин на шейкере при +20°С, после чего трижды отмывали PBSTw. Для визуализации связывания лигандов на подложке использовались вторичные антитела различных типов, конъюгированные с пероксидазой хрена (ЗАО «Имтек»,). Их вносили во все лунки ряда планшета, включая последнюю, в стандартном разведении 1:1000 в буфере PBS. Для выявления сывороточных IgA1 и IgA2, а также S-IgA использовали козьи поликлональные антитела против -цепей Ig человека (pGAH-Iaa), IgM – кроличьи антитела против -цепей Ig человека (pRAH-Imm), IgG – кроличьи антитела против суммарных иммуноглобулинов человека (pRAH-Iss), Ig кролика – козьи антитела против суммарных Ig кролика (pGARI).

Инкубировали 60 мин на шейкере при +20°С, после чего трижды отмывали PBSTw и добавляли субстратный буфер (0.01 % ортофенилендиамин, 0.01% Н2О2, 40 мМ Na-цитрат, рН 4.7), который готовили непосредственно перед применением и вносили в количестве 100 мкл в каждую лунку. Через минут после внесения субстратного буфера реакцию останавливали внесением 10% H2SО4 объемом 30 мкл в лунку. А492 измеряли с помощью планшетного ридера (Multiscan). По показаниям прибора строили графические зависимости А492 (ось Y) от степени разведения субстрата, которой соответствовала определенная его концентрация (ось X).

2. Результаты исследования и их обсуждение 2.1. Cхема эксперимента по получению изолированных доменов IgAl-специфичной протеазы с помощью рекомбинантных продуцентов на основе E. coli. IgAl-протеаза N. meningitidis принадлежит к классу сериновых протеаз (клан химотрипсина) и имеет размер предшественника 180 кДа, в том числе зрелый фермент 105 кДа и С-концевой секреторный домен 75 кДа. Поскольку типичная молекулярная масса сериновых протеаз самого различного происхождения находится в диапазоне от 20 до 30 кДа, и лишь сложно регулируемые ферменты этого типа, например, плазмин, имеют бльший размер, возникает вопрос о функциональной роли той части полипептидной цепи IgA1-протеазы, которая выходит за пределы необходимой для проявления каталитической активности.

При сопоставлении последовательности IgA1-протеазы менингококка с другими протеазами клана химотрипсина удалось установить отдаленное сходство структуры N-концевой части молекулы фермента с последовательностью зрелого калликреина 1 человека (236 а.о.).

Выравнивание последовательностей калликреина и IgA1-протеазы менингококка позволило выявить ключевой остаток каталитического центра сериновых протеаз - Ser195 по адресации химотрипсина. При этом вся последовательность калликреина по профилю гидрофобности совпала с Nконцевой частью зрелой IgA1-специфичной протеазы. Принимая во внимание тот факт, что ключевые остатки каталитического центра IgAlпротеазы (VLGDSGSPLF) сосредоточены вблизи N-конца зрелого пептида, членение аминокислотной последовательности IgAl-протеазы было проведено на фрагменты 29 и 85 кДа. Таким образом, в рамках экспериментальной проверки выдвинутой гипотезы о двухдоменной организации IgAl-протеазы N. meningitidis на первом этапе нашей работы были приблизительно определены границы аминокислотных последовательностей предполагаемых каталитического (КТД) и некаталитического субстрат-связывающего доменов (НСД).

Следующим этапом работы стало клонирование фрагментов генов IgA1-протеазы N. meningitidis, соответствующих установленным границам КТД и НСД. Поскольку в нашем распоряжении не имелось клонированного гена полноразмерной IgA1-протеазы менингококка, для получения обозначенных последовательностей использовали геномную ДНК штаммов N. meningitidis M9 и A208, изолированных на территории нашей страны во время эпидемических вспышек.

Для ПЦР-амплификации целевых фрагментов были разработаны олигонуклеотидные праймеры на наиболее консервативные участки последовательностей IgA1-протеаз различных серогрупп, находящиеся вблизи предполагаемых границ доменов. Это условие диктовалось необходимостью учета полиморфизма генов IgA1-протеаз из различных источников, который мог осложнить проведение ПЦР при работе со штаммами, не подвергавшимися прежде генотипированию.

Следует отметить, что амплифицируемые фрагменты гена IgA1протеазы, соответствующие КТД и НСД, перекрывались на 54 п.н. Таким образом, на N-конце НСД в качестве пептидного линкера оказывался небольшой фрагмент КТД (<18 а.о.). Это решение было принято, поскольку примененный метод давал лишь оценочные представления о расположении С-конца КТД, а приобретение доменом компактной структуры кооперативно и, как правило, возможно лишь при наличии всех составляющих его а.о.

Участок гена IgA1-протеазы, соответствующий НСД длиной 2110 п.н., был получен в результате ПЦР на матрице геномной ДНК штамма N. meningitidis M9 (серогруппа А) с использованием праймеров IgA2dop (BamHI) 5' – GG GGA TCC TAC GAT TAT TGG GCAGGC TA - 3' и IgA2rev (SalI) 5' - GAT GTC GAC TCG GCG GCG GTT CTC GGC ATA AGG AT - 3'.

Фрагмент гена, соответствующий КТД длиной 786 п.н., получали на базе геномной ДНК штамма N. meningitidis А208 (серогруппа А) с использованием праймеров IgA2for (BamHI) 5' – ATT GGA TCC TAC TCA GAA GCG GCA TTG GTC AGA GA - 3' и IgA2dom (SalI) 5' - GAT GTC GAC TTA ATC GCG TTG TTT GAT TTC AT- 3'. ПЦР проводилась при следующих параметрах: 94°С -30”, 58°С – 30”, 72°С – 60”, 30 циклов при концентрации геномной ДНК в смеси 0.01 мкг/мкл. Используя введенные в составе праймеров сайты рестриктаз BamHI и SalI, оба продукта ПЦР вводили в экспрессионный вектор pQE-30. В случае фрагмента, соответствующего КТД, в сайт вектора BamHI вводили дополнительно ген GFP, полученный в форме продукта ПЦР, и несущий на флангах сайты BamHI и BglII соответственно. В результате были получены экспрессионные конструкции рQG-A2C (КТД) и рQ-M2B (НСД), дизайн которых представлен на рис. 1.

а. Полноразмерная IgA1-протеаза SerКТД ССД - 685 a.о.

BamHI SalI 2110 п.н.

б.

T5 пр 6His pQ-M2B SD 6His-tag BamHI AAAGAGGAGAAATTAACT ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC M R G S H H H H H H G S праймер IgA2dop TAC GAT TAT TGG GCA GGC TAT CAA AAA AAC TCT TGG CAA GAA TGG AAT Y D Y W A G Y Q K N S W Q E W N … в.

Полноразмерная IgA1-протеаза 847 a.о.

SerССД КТД - 262 a.о.

BamHI SalI GFP 750 п.н.

786 п.н.

T5 пр 6His pQG-A2C г.

GFP (BglII/BamHI) праймер IgA2for gac gag ctg tac aag aga tcc tca gaa gcg gca ttg gtc aga gac ggt gtc D E L Y K R S S E A A L V R D G V Рис. 1. Дизайн экспрессионных конструкций pQ-M2B (а) и pQG-A2C (в) для получения изолированных белков НСД и КТД соответственно. В пунктах б и г приведены фрагменты конструкций, соответствующие N-концевым участкам последовательностей IgA1-протеазы.

Путем введения pQ-M2B и pQG-A2C в штамм E. coli NM522 были получены продуценты соответствующих белков. Следует отметить, что продукт конструкции рQG-A2C представлял собой химеру, где в качестве Nконцевого компонента выступал зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein-GFP). Целью введения этого элемента являлось улучшение продукции белка клетками E. coli на стадии трансляции. Кроме того, оба рекомбинантных производных гена IgA1-протеазы - Q-M2B и QG-A2C - содержали на N-конце последовательность из 6 а.о. His.

Для препаративной наработки белков Q-M2B и QG-A2C осуществлялась стандартная ферментация в 24 колбах Эрленмейера (750 мл) по 30 мл среды LBS в каждой, в результате чего удавалось собрать 5 г влажной биомассы. Целевой продукт выделяли исключительно из нерастворимой клеточной фракции (телец включений). Изначально наличие целевого продукта в пробе визуализировали с помощью ДСН-ПААГ, где целевые белки мигрировали в соответствие с ожидаемой молекулярной массой: 85 кДа для Q-M2B и 54 кДа для QG-A2C. Стоит отметить, что выбор экспрессии в виде телец включения обеспечил высокую воспроизводимость выхода продукта и его стабильность при хранении в концентрированном состоянии. В готовом препарате телец включения доля целевого белка составляет 50-70% от массы общего. Для оценки выхода рекомбинантного продукта, содержание белка в полученных препаратах телец включения измеряли по модифицированному методу Лоури с бицинхониновым реагентом. Было определено, что максимально возможный выход за один цикл ферментации для белка QG-А2С составляет 30 мг (40 мг с 1 л культуры), для Q-M2B – 50 мг (70 мг с л культуры).

2.2. Получение и очистка рекомбинантных белков в активной форме. Для солюбилизации телец включения Q-M2B нами была применена оригинальная методика размыкания дисульфидных связей в окислительных условиях с помощью сульфитолиза, уравнение реакции которого приведено на рис. 2.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»