WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

КАЗЕЕВА Тамара Николаевна ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ IgA1-СПЕЦИФИЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ NEISSERIA MENINGITIDIS Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена во временном научном коллективе «Биохимия мышц» Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук А.Б. Шевелев

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф. Л.Д. Румш кандидат биологических наук А.В. Жердев

Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 30 октября 2008 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_» сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеазы, расщепляющие иммуноглобулины А1 (IgA1) человека, представляют собой высокоспецифичные ферменты, действующие на строго определенные пептидные связи в шарнирном регионе субстрата. Продукция IgA1-протеаз характерна для таких удаленных в систематическом отношении бактериальных патогенов человека, как Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, которые вызывают у человека ряд опасных заболеваний: менингит, синусит, отит, бронхит, пневмонию, венерические заболевания и др. Ряд косвенных данных позволяет рассматривать эти ферменты в качестве одного из факторов патогенности микроорганизмов (Mistry et. al., 2006). Общепринятой является точка зрения, что их роль сводится к расщеплению секреторных IgA1, которые в больших количествах присутствуют на слизистых оболочках и обеспечивают первую линию защиты от бактериальных патогенов.

Деградация антител IgA1-протеазами, таким образом, ослабляет иммунитет слизистых, что приводит к адгезии бактерий на стенках эпителия и колонизации ими слизистых. Однако активность IgA1-протеаз была экспериментально выявлена в таких биологических средах, как кровь, цереброспинальная жидкость и др., взятых от пациентов с соответствующими заболеваниями, что не позволяет рассматривать расщепление секреторных антител в качестве единственной функции этих ферментов (Vitovski et. al., 2002).

Работа по исследованию IgA1-протеаз осложнена, в первую очередь, отсутствием эффективных подходов, позволяющих получать функционально активный фермент в необходимом количестве. В результате до настоящего времени не установлена пространственная структура ферментов данного типа. Выделение IgA1-протеаз из природных источников связано с рядом трудностей: работа с патогенными микроорганизмами, подбор сред сложного состава для их культивирования, низкий уровень продукции фермента.

Таким образом, для изучения функций IgA1-протеаз в патогенезе, особенностей фермент-субстратных взаимодействий и разработки эффективных ингибиторов требуется создание рекомбинантных продуцентов, позволяющих получать достаточные количества фермента и его мутантных производных. Однако эта техническая проблема до настоящего времени остается нерешенной.

Важной предпосылкой настоящей работы является впервые высказанная нами гипотеза о мультидоменной организации сериновых IgA1протеаз (EC 3.4.21.72) по аналогии с другими известными протеазами с большой молекулярной массой: энтеропептидазой и бутулиническим токсином. Было предположено, что в структуре IgA1-протеазы наряду с каталитическим присутствует некаталитический субстрат-связывающий домен, ответственный за специфичное распознавание и связывание субстрата. Эта гипотеза имеет теоретическую значимость, позволяя планировать эксперименты в области изучения ферментативной кинетики и субстратной специфичности IgA1-протеаз. Она важна и с точки зрения разработки ингибитора этих ферментов, который традиционно рассматривается в качестве перспективного агента для терапии перечисленных бактериальных инфекций. Наконец, расчленение IgA1протеазы на изолированные домены могло бы оказаться удобным средством для создания рекомбинантных продуцентов фермента в условиях, когда продукция полноразмерного фермента в существующих системах экспрессии затруднена.

Цель и задачи исследования. В качестве цели работы рассматривалась экспериментальная проверка впервые выдвинутой нами гипотезы о двухдоменной организации сериновых IgA1-протеаз на примере фермента из N. meningitidis, что обусловливает наличие в их структуре двух центров взаимодействия с субстратом: каталитического и некаталитического субстрат-связывающего.

В экспериментальные задачи работы входило:

1. Определение границ предполагаемых каталитического и некаталитического субстрат-связывающего доменов путем сопоставления аминокислотных последовательностей различных сериновых протеаз и IgA1протеазы менингококка; клонирование выбранных фрагментов генов, соответствующих доменам, с помощью ПЦР и разработка систем экспрессии рекомбинантных белков в E. coli.

2. Разработка систем очистки и ренатурации полученных белковдоменов.

3. Изучение субстратной специфичности изолированного каталитического домена и сопоставление показанной активности с активностью нативного фермента из культуральной жидкости менингококка.

4. Разработка критериев оценки выхода нативного продукта при ренатурации изолированного некаталитического субстрат-связывающего домена.

5. Изучение специфичности и аффинности распознавания белковлигандов изолированным некаталитическим субстрат-связывающим доменом.

Научная новизна и практическая значимость работы1. В рамках данной работы впервые выдвинуто предположение о существовании у IgA1 Список сокращений: а.о. – аминокислотный остаток; БСА – бычий сывороточный альбумин; ДСН – додецилсульфат натрия; ДТТ – дитиотрейтол; КТД – каталитический домен;

НСД – некаталитический субстрат-связывающий домен; ПААГ – полиакриламидный гель; п.н. – пара нуклеотидов; тИФА – твердофазный иммуноферментный анализ; ТХУ – трихлоруксусная кислота; Ig – иммуноглобулин; NCA – Na-карбонатный буфер; PBS – фосфатно-солевой буфер;

PBSTw – фосфатно-солевой буфер с Твин-20; S-IgA – секреторный иммуноглобулин А протеазы N. meningitidis как минимум двух доменов, выполняющих различные функции. N-концевая часть полипептидной цепи, включающая в себя типичный для сериновых протеаз каталитический сайт (VLGDSGSPLF), отвечает за протеолитическую активность фермента, формируя каталитический домен. Другая же, бльшая С-концевая часть молекулы ответственна за специфичное распознавание и связывание субстрата (в виде IgA человека) – некаталитический субстрат-связывающий домен. В ходе работы нам удалось осуществить раздельную экспрессию белков, моделирующих каждый из двух предполагаемых доменов, и исследовать их функциональную активность in vitro. Каталитический домен сохранил способность расщеплять IgA1 человека – единственный природный субстрат полноразмерного фермента, обладающий высокой устойчивостью к протеолизу неспецифическими протеазами. Также была подтверждена способность C-концевого домена связывать IgA человека. Нам впервые удалось показать, что полученный белок образует комплексы как с сывороточными, так и секреторными IgA, причем аффинность в отношении IgA2 оказалась несколько выше, чем в отношении IgA1. Обнаруженные свойства данного белка-домена позволят создать на его основе сорбенты для препаративного выделения IgA из природных источников, а также разработать высокоспецифичные иммунореагенты для детекции IgA в различных вариантах иммуноферментного анализа. Полученные данные о функциональных особенностях IgA1-протеазы в дальнейшем могут быть использованы при уточнении роли этого фермента в развитии менингококковой инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. IgA1-протеаза N. meningitidis содержит два функциональных домена:

каталитический и некаталитический субстрат-связывающий.

2. Каталитический домен сохраняет способность к расщеплению IgAчеловека - природного субстрата полноразмерного фермента.

3. Изолированный некаталитический субстрат-связывающий домен обладает способностью к избирательному высокоаффинному связыванию сывороточных IgA1 и IgA2 человека, а также секреторных IgA человека.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Biocatalysis – 2005: fundamentals and applications» (St.Petersburg, 2005); Юбилейных Научных Чтениях, посвященных 110-летию со дня рождения проф. Н.А. Преображенского (Москва, 2006) и 17-ом Европейском конгрессе «Clinical Microbiology and Infectious Diseases ICC», (Germany, Munich, 2007).

Публикации. По теме работы опубликовано 5 печатных работ (статей в рецензируемых журналах – 2, тезисов конференций - 3).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и включает 25 рисунков и таблицы. Работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 183 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы 1.1. Штаммы E. coli и N. meningitidis. Векторные плазмиды.

Клинические и биологические материалы. Для клонирования, получения плазмидной ДНК и получения биомассы рекомбинантных продуцентов использовался штамм E. coli NM522 (thi, supE, F’proAB, lacIq ZM15).

Для экспрессии фрагментов гена IgA1-протеазы использовали вектор pQE30 (Invitrogen), несущий промотор фага Т5 и предназначенный для продукции белков с N-концевым 6His-тагом. При экспрессии каталитического домена IgA1-протеазы в этот вектор дополнительно вводили полноразмерный ген зеленого флуоресцентного белка (ECFP1, Clontech, кат.

№ 6901-1), таким образом, чтобы на N-конце кодируемого белка оказывался 6His, а на 3’-конце открытой рамки считывания – ген предполагаемого каталитического домена IgA1-протеазы.

Штаммы М9 и А208 N. meningitidis серогруппы А, вызвавшие эпидемические вспышки в 1979 и 1984 гг., получены из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича РАМН. Геномная ДНК и культуральные жидкости этих штаммов, обладающие активностью IgA1-протеазы, предоставлены Государственным научным центром промышленной микробиологии (г. Оболенск, Московская область).

Использовались образцы плазмы крови больных миеломой, обогащенные моноклональными IgA1 или IgA2 (Гематологический научный центр им. А.А. Богданова РАМН), и плазмы крови здоровых доноров (МГЦ «СПИД»).

1.2. Получение биомассы рекомбинантных продуцентов на базе E. coli. Для получения рекомбинантных белков в виде телец включения использовали посевной материал, представляющий собой смыв колоний с чашек Петри после трансформации. Клеточную суспензию, полученную с одной 90 мм чашки, вносили в две колбы Эрленмейера (750 мл), содержащие 30 мл среды LBS (10 г/л пептон (Difco), 5 г/л дрожжевой экстракт (Difco), 20 г/л NaCl, 100 мг/л ампициллин) и инкубировали в течение 9 часов при аэрации со скоростью 250 g при 30C. Выращенную биомассу собирали центрифугированием, клетки ресуспендировали в 40 мМ буфере Трис-HCl, рН 8.0, охлаждали до 0°С и проводили многократную дезинтеграцию с помощью ультразвукового диспергатора, не допуская нагревания свыше 15°С. Тельца включения отделяли от растворимых клеточных белков центрифугированием при 1500 g и хранили при -20C.

1.3. Очистка и ренатурация белков 1.3.1. Солюбилизация телец включения некаталитического субстрат-связывающего домена (белок Q-M2B) в окислительных условиях - сульфирование). Сульфирование препарата телец включения белка Q-M2B общей массой 2 г проводили смесью реагентов, состоящей из 50 мМ безводного бисульфита натрия (NaHSО3) и 50 мМ тетратионата калия (K2О6S4) с добавлением сухой мочевины до 8 М. Солюбилизацию телец включения проводили в течение 12 часов при 37°С в общем объеме реакционной смеси 10 мл, используя в качестве буферного раствора 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0. Выход сульфированного препарата после отделения нерастворимого осадка оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.

1.3.2. Солюбилизация телец включения каталитического домена (белок QG-A2C) в восстановительных условиях. В качестве исходного материала для дальнейшей очистки и ренатурации белка QG-A2C служил препарат телец включения. В одном эксперименте использовали 20 мг данного препарата, солюбилизируя его в растворе 8 М мочевины в присутствии 50 мМ -меркаптоэтанола. Объем реакционной смеси доводили дистиллированной водой до 10 мл и инкубировали на микробиологической качалке в течение 2-6 часов при комнатной температуре.

1.3.3. Анионообменная хроматография белков на DEAE Toyo Pearl в денатурирующих условиях. Хроматографическую колонку Pharmacia с двумя адаптерами (высота 50 см, объем 50 мл) уравновешивали, пропуская 50 мл исходного буфера Трис-HCl, рН 8.8, для белка Q-M2B, либо рН 8.2 для QG-A2C. После этого наносили целевой белок в объеме 50-250 мл раствора с конечной концентрацией мочевины в нем 4 М в буфере того же состава, которым уравновешивали колонку. Элюцию связавшегося на колонке материала проводили, подавая на нее градиент NaCl в буфере для нанесения от 0 до 1 М. Профиль хроматографии регистрировали, измеряя А280 с помощью проточного ультрафиолетового детектора. Для фракций, по данным определения А280 содержащих значительные количества сухого вещества, при помощи денатурирующего электрофореза в ПААГ исследовали качественный состав белков. При необходимости собранные фракции, содержащие очищенные рекомбинантные белки в денатурированной форме, концентрировали в 2-10 раз с помощью центрифужного ультрафильтрационного патрона Tosoho с пределом пропускания 10 кДа.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»