WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     ||
|

видно из рисунка 10А-В, начальные участки зависимостей Rh от времени удовлетворительно описываются уравнением (10). Результаты расчетов представлены в таблице 2.

Величина t0, характеризующая длительность лаг-периода процесса агрегации, Относительная интенсивность увеличивается с ростом концентрации -кристаллина. Значения параметра 1/t2R, полученные при различных концентрациях -кристаллина, свидетельствуют о том, что скорость агрегации в присутствии -кристаллина снижается.

Таблица 2. Параметры уравнений (8) и (10), используемых для описания кинетики тепловой агрегации мААТ (0,2 мг/мл) при 60 °С в присутствии -кристаллина Концентрация Rh,0 (нм) t0 (мин) tcrit (мин) I2 10-3 (1/t2R) -кристаллина [(фотоотсчет/с)/нм] (мин-1) (мг/мл) 0,1 42,6 ± 0,4 16,4 ± 0,1 57,5 ± 1,1 1,00 ± 0,0,15 15,5 ± 0,3 19,7 ± 0,2 66,1 ± 1,4 0,89 ± 0,0,2 6,5 ± 0,1 17,1 ± 0,2 93,0 ± 4,0 0,07 ± 0,0,4 — — — — 19,4 ± 0,Следует отметить, что при концентрации -кристаллина, равной 0,4 мг/мл, размер частиц в системе остается постоянным (Rh = 19,4 ± 0,1 нм), по крайней мере, в течение 1200 мин (рис. 12Г).

А2000 Б 1500 1000 30 0 100 200 500 0 100 0 0 200 400 600 0 200 400 В2000 Г 0 200 0 0 200 400 600 800 0 300 600 900 t (мин) t (мин) Рис. 12. Зависимости величины гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для агрегации мААТ при 60 °С в присутствии -кристаллина. Концентрации -кристаллина: 0,1 (А), 0,15 (Б), 0,2 (В) и 0,(Г) мг/мл. На вставках показаны начальные участки зависимостей Rh от t. Сплошные линии на вставках к рисункам А, Б и В рассчитаны при помощи уравнения (10).

Экспоненциальный характер зависимости величины гидродинамического радиуса от времени при агрегации мААТ в присутствии -кристаллина означает, что агрегация протекает в режиме, при котором вероятность слипания частиц меньше единицы h R (нм) h R (нм) (reaction-limited cluster-cluster aggregation, RLCA). Таким образом, -кристаллин защищает мААТ от агрегации вследствие уменьшения вероятности слипания частиц, образующихся в процессе агрегации. Полученный результат согласуется с выводами о механизме защитного действия -кристаллина, сделанными ранее исследователями, изучавшими тепловую агрегацию L-кристаллина (Khanova et al., 2005), ГАФД (Khanova et al., 2006) и гликогенфосфорилазы b (Meremyanin et al., 2008) в присутствии -кристаллина.

3. Изучение стадии образования стартовых агрегатов на примере тепловой агрегации ГАФД Для того чтобы более подробно охарактеризовать начальную стадию тепловой агрегации белков, а именно стадию образования стартовых агрегатов, мы подобрали условия для агрегации ГАФД, при которых одновременно регистрируются исходная (нативная) форма белка и белковые агрегаты: 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5; 45 °С;

ГАФД 1 и 3 мг/мл.

На рис. 13 представлена зависимость интенсивности светорассеяния (I) от времени для процесса тепловой агрегации ГАФД (1 и 2 мг/мл) при 45 °С. Длительность лагпериода, обозначенная нами как параметр t2, для каждой зависимости I от времени представлена в таблице 3.

Уменьшение скорости агрегации при увеличении концентрации ГАФД от 1 до мг/мл оказалось неожиданным. Это факт можно объяснить следующим образом. Методом 100000 ДСК показано, что термостабильность ГАФД повышается с ростом концентрации белка в интервале от 0,5 до 3,0 мг/мл (Markossian et al., 2006). Таким образом, более низкую скорость тепловой агрегации ГАФД при концентрации 3 мг/мл, в сравнении с концентрацией 1 мг/мл, можно 010 20 объяснить замедлением первой стадии t (мин) Рис. 13. Кинетика тепловой агрегации ГАФД при агрегации белка — стадии диссоциации 45 °С (10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5).

Зависимости интенсивности светорассеяния, белковой молекулы.

полученные при концентрации белка 1 (1) и 3 (2) мг/мл.

Таблица 3. Кинетические параметры тепловой агрегации ГАФД при 45 °С (ГАФД) (мг/мл) Rh,0 (нм) t1 (мин) t2 (мин) t3 (мин) 1,0 97 ± 2 5,3 ±0,3 4,0 ± 0,3 8,0 ± 0,3,0 95 ± 2 3,3 ±0,3 4,5 ± 0,3 17,0 ± 0, I (фотоотсчет/с) А На рис. 14 показано распределение 0.частиц по размерам при разных времена 0.инкубации ГАФД (1 мг/мл) при 45 °С. При 0.малых временах инкубации распределение 0.представлено одним пиком, соответствующим нативной форме ГАФД 0.(рис. 14А, t = 3 мин). Среднее значение 0.1 10 100 гидродинамического радиуса этого пика Б 0.составляет 5,4 ± 0,3 нм. В ходе агрегации 0.появляется еще один пик, 0.21 соответствующий агрегированному состоянию белка, который со временем 0.начинает смещаться в сторону увеличения 0.Rh (рис. 14Б-В).

0.На рис. 15 представлены 1 10 100 В 0.зависимости величины гидродинамического радиуса белковых агрегатов, 0.образующихся в процессе тепловой 0.агрегации ГАФД (1 и 3 мг/мл), от времени.

0.Стартовые агрегаты появляются при t = 5,0.и t = 3,3 мин, соответственно, при концентрациях ГАФД 1 и 3 мг/мл 0.1 10 100 Rh (нм) (параметр t1 в таблице 3). Размер стартовых Рис. 14. Распределение частиц ГАФД (1 мг/мл) по агрегатов равен 97 ± 2 и 95 ± 2 нм при величине гидродинамического радиуса. Времена инкубации: 3 (А), 5,5 (Б) и 17 (В) мин.

концентрациях ГАФД, соответственно, 1 и 3 мг/мл. В таблице 3 имеется также параметр t3 — момент времени, при котором гидродинамический радиус стартовых агрегатов начинает расти. Для концентраций ГАФД 1 и 3 мг/мл значение параметра t3 равно 8,0 ± 0,3 и 17,0 ± 0,3 мин, соответственно. Таким образом, повышение интенсивности светорассеяния в интервале значений времени от t2 = 4,0 мин до t3 = 8,0 мин при концентрации ГАФД 1 мг/мл и в интервале от t2 = 4,5 мин до t3 = 17,0 мин при концентрации ГАФД 3 мг/мл происходит исключительно вследствие накопления стартовых агрегатов без изменения их размера.

Таким образом, изучение процесса агрегации ГАФД при 45 °С показало, что образование стартовых агрегатов на первом этапе агрегации происходит по принципу «все или ничего», без образования интермедиатов.

Относительная интенсивность A 400 Б 300 200 100 0 0 5 10 15 t (мин) t (мин) Рис. 15. Зависимость величины гидродинамического радиуса для исходной ГАФД (• ) и белковых агрегатов ( ) от времени для агрегации ГАФД при 45 °С. Концентрация ГАФД: 1 (А) и 3 (Б) мг/мл.

4. Влияние GroEL на тепловую агрегацию ГАФД Представляло интерес выяснить, каков механизм подавления агрегации шаперонами, не относящимися к семейству малых белков теплового шока. В качестве такого шаперона нами был выбран GroEL, относящийся к классу шаперонинов 60. GroEL состоит из 14 идентичных 57 кДа–субъединиц, образующих два гептамерных кольца с большой полостью в центре (Braig et al., 1994), (Bukau and Horwich, 1998). Способность GroEL подавлять агрегацию белковых субстратов продемонстрирована в работах HollNeugebauer et al. (1991), Martin et al. (1992), Mendoza et al. (1992), Hartman et al. (1993), Marchenkov et al. (2006).

Для изучения механизма защитного действия GroEL нами была изучена агрегация ГАФД при 45 °С в присутствии различных концентраций GroEL. Как видно на рис. 16, добавление GroEL приводит к 3 уменьшению начального прироста интенсивности светорассеяния. На рис. представлены зависимости гидродинамического радиуса Rh от 0 времени для тепловой агрегации ГАФД 0 100 200 t (нм) (0,4 мг/мл) при концентрациях GroEL, Рис. 16. Подавление тепловой агрегации ГАФД шапероном GroEL (10 мМ Na-фосфатный буфер, равных 0,15, 0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл.

pH 7,5). Зависимости интенсивности светорассеяния Характерная особенность этих от времени для процесса агрегации ГАФД (0,мг/мл) при 45 °С в присутствии GroEL в концентразависимостей заключается в том, что циях: 0 (1), 0,15 (2), 0,3 (3), 0,6 (4) и 1,2 (5) мг/мл.

h R (нм) I (фотоотсчет/с) величина Rh остается постоянной в течение длительного времени. Расчеты показали, что среднее значение Rh,0 (52,5, 58,7, 57,1 и 61,9 нм при концентрациях GroEL 0,15, 0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл, соответственно) очень близко к таковому в отсутствие GroEL (Rh,0 = 65,5 нм).

При временах выше t3 (таблица 5) повышение значения Rh с течением времени описывается экспоненциальной функцией. Сплошные кривые на рис. 17А-Г рассчитаны по уравнению (10). Уменьшение значения 1/t2R с повышением концентрации GroEL указывает на снижение скорости агрегации.

Таблица 5. Параметры Rh,0, t3 и 1/t2R для зависимостей Rh от времени, полученные для агрегации ГАФД (0,мг/мл), при 45 °С в отсутствие и в присутствии GroEL Концентрация Rh,0 (нм) t3 (мин) 1/t2R (мин-1) GroEL (мг/мл) 0 65,5 ± 1,3 4,5 ± 0,2 0,526 ± 0,0,15 52,5 ± 1,9 7,7 ± 0,4 0,217 ± 0,0,3 58,7 ± 2,3 12,3 ± 1,3 0,132 ± 0,0,6 57,1 ± 1,3 49,2 ± 1,5 0,069 ± 0,1,2 61,9 ± 1,5 99,5 ± 4,3 0,015 ± 0,A Б600 400 200 0 020 4060 0 20 40 60 В Г0 0 50 100 150 200 0 100 200 t (нм) t (нм) Рис. 17. Зависимости величины гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для агрегации ГАФД при 45 °С в присутствии GroEL. Концентрации GroEL: 0,15 (А), 0,3 (Б), 0,6 (В) и 0,12 (Г) мг/мл.

Сплошные кривые проведены по уравнению (10).

h R (нм) h R (нм) Известно, что тепловая агрегация ГАФД протекает в диффузионно- контролируемом режиме (Markossian et al., 2006). Тот факт, что начальные участки зависимостей гидродинамического радиуса от времени для агрегации ГАФД в присутствии GroEL описываются экспоненциальным уравнением, указывает на индуцированный шапероном переход процесса агрегации из диффузионноконтролируемого режима в кинетический режим, при котором вероятность слипания сталкивающихся частиц становится меньше единицы. Таким образом, механизмы защитного действия -кристаллина и GroEL сходны и заключаются в снижении вероятности слипания частиц при столкновении. В то же время можно отметить следующие различия в характере взаимодействия -кристаллина и GroEL с развернутыми формами ГАФД. Взаимодействие -кристаллина с денатурированной ГАФД блокирует образование стартовых агрегатов (Markossian et al., 2006). Что касается GroEL, то, как показывают полученные нами данные, его взаимодействие с развернутой молекулой ГАФД не препятствует образованию стартовых агрегатов. Тем не менее, встраивание GroEL в стартовые агрегаты снижает вероятность их слипания. Можно полагать, что -кристаллин и GroEL взаимодействуют с разными участками развернутой молекулы ГАФД.

5. Доказательство наличия шапероноподобной активности у дрожжевой алкогольдегидрогеназы I Кинетика агрегации дрожжевой АДГ I, изученная методом динамического светорассеяния, отличается от кинетики агрегации других белков. Особенности кинетики агрегации АДГ I таковы: начальные участки зависимости Rh белковых агрегатов от времени подчиняются экспоненциальному закону, и наблюдается расщепление популяции агрегатов на два компонента при достаточно больших временах инкубации (Markossian et al., 2006). Подобная кинетика агрегации характерна для агрегации белков в присутствии шаперонов (например, -кристаллина). Нами высказано предположение, что АДГ I может защищать себя при тепловой агрегации, то есть обладает шапероноподобной активностью.

В качестве тест-системы при проверке шапероноподобной активности АДГ I была использована агрегация УФ-облученного L-кристаллина. Агрегация УФ-облученного L-кристаллина (0,2 мг/мл) протекает с достаточно высокой скоростью при 37 °С (рис. 18, кривая 1). АДГ I (1 мг/мл) при 37 °С не агрегирует (рис. 18, кривая 2). Кривая 3 (рис. 18) соответствует агрегации УФ-облученного L-кристаллина (0,2 мг/мл) в присутствии АДГ I (1 мг/мл).

Из анализа представленных данных становится очевидным, что АДГ I подавляет агрегацию УФ-облученного L-кристаллина. Это доказывает, что нативная молекула АДГ I обладает 3 шапероноподобной активностью.

0 Известно, что пептид 0 40 80 -YSGVCHTDLHAWHGDWPLPVK (40– t (мин) Рис. 18. Влияние АДГ I на агрегацию УФ60)-, аналогичный участку 40-облученного L-кристаллина (100 мМ NaCl, 50 мМ аминокислотной последовательности Na-фосфатный буфер, pH 7,4). Зависимости интенсивности светорассеяния от времени.

АДГ I, обладает способностью подавлять Концентрация белков: 0,2 мг/мл УФ-облученного L-кристаллина (1), 1 мг/мл АДГ I (2) и смесь УФагрегацию белковых субстратов облученный L-кристаллин 0,2 мг/мл + АДГ I 1 мг/мл (3).

(Bhattacharyya, 2003). Можно полагать, что именно фрагмент 40-60 обеспечивает наличие шапероноподобной активности АДГ I.

Анализ кинетики агрегации белков методом динамического светорассеяния позволяет оценить размеры образующихся белковых агрегатов и проследить за тем, как меняется характер распределения белковых агрегатов по размеру по ходу процесса агрегации. На основании полученных данных можно судить о механизме агрегации белков, о механизме защитного действия шаперонов, а также высказать предположение о наличии внутримолекулярного шаперона в исследуемой молекуле белка.

Результаты исследований тепловой агрегации белков, выполненных в настоящей работе, согласуются с идеей о том, что начальной стадией агрегации является стадия образования стартовых агрегатов, включающих сотни молекул денатурированного белка.

Дальнейшее слипание стартовых агрегатов протекает в диффузионно-контролируемом режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении равна единице. В рамках этой концепции защитное действие шаперона интерпретируется как результат уменьшения вероятности слипания стартовых агрегатов при включении в их состав шаперона.

I (фотоотсчет/с) ВЫВОДЫ 1. Тепловая инактивация митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) из сердца свиньи происходит быстрее, чем разворачивание белковой молекулы, что согласуется с гипотезой Ch.-L. Tsou о более высокой чувствительности активного центра к денатурирующим воздействиям по сравнению с белковой глобулой.

Предложена кинетическая модель, объясняющая расхождение между скоростями инактивации и денатурации мААТ. Показано, что доля агрегированного белка совпадает с долей денатурированного белка. Установлено, что тепловая агрегация аспартатаминотрансферазы протекает в диффузионно-контролируемом режиме.

2. На основании изучения кинетики тепловой агрегации глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния получены доказательства того, что начальная стадия тепловой агрегации белков — стадия образования стартовых агрегатов из денатурированных молекул белка — протекает по принципу «все или ничего», без образования интермедиатов.

3. Показано, что механизмы подавления тепловой агрегации белков -кристаллином и GroEL сходны и заключаются в том, что в обоих случаях шаперон индуцирует переход процесса агрегации из диффузионно-контролируемого режима в кинетический режим, при котором вероятность слипания частиц при столкновении становится меньше единицы.

Pages:     ||
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.