WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     ||
|

den Ea 1 kden = exp - мин-1, (3) -2 R T1den T den где Ea — энергия активации для процесса -денатурации, T1den — абсолютная температура, при которой kden = 1 мин-1, R — -универсальная газовая постоянная.

t (мин) Как видно из рис. 2, экспериРис. 3. Влияние температуры на кинетику инактивации мААТ (0,1 мг/мл). Зависимости ментальные данные удовлетворительно относительной ферментативной активности мААТ (A/A0) от времени в полулогарифмических описываются теоретическими уравнениями, координатах, полученные при различных что указывает на выполнимость температурах инкубации: (1) 50, (2) 57,5, (3) 61, (4) 65, (5) 68, (6) 72 и (7) 77 °С.

den кинетической схемы N k D.

ex p C (кДж/моль*К) ln( A / A ) ln( A / A ) На рис. 3 представлена кинетика тепловой инактивации мААТ при различных температурах. Падение относительной ферментативной активности А/А0 оказывается линейным в координатах {ln(А/А0); время} (А0 и А — начальное и текущее значение ферментативной активности). Это указывает на то, что кинетика инактивации подчиняется экспоненциальному закону: A/A0 = exp(–kint), где kin — константа скорости инактивации.

Зависимость константы kin от температуры описывается уравнением Аррениуса:

in Ea 1 kin = exp - мин-1, (4) R T1in T in где Ea – энергия активации для процесса инактивации, T1in - температура, при которой in kin = 1 мин-1 (прямая 1 на рис. 4). Параметры Ea и T1in определены равными 405,4 ± 1,5 кДж/моль и 345,99 ± 0,02 К соответственно. Пунктирная линия (2) на этом рисунке соответствует зависимости lnkden от 1/Т, рассчитанной по данным ДСК. Как видно из рисунка, во всем изученном интервале температур (от 57,5 до 77 °С) константа скорости инактивации превышает константу скорости денатурации.

Величина отношения kin/kden с ростом -температуры снижается от значения 28,-при 57,5 °С до значения 1,3 при 77 °С.

-Таким образом, инактивация мААТ -происходит быстрее, чем полное -разворачивание белковой молекулы, что 2.85 2.90 2.95 3.согласуется с гипотезой Ch.-L. Tsou (Цоу, -103 (K ) T 1998; Tsou, 1998) относительно более Рис. 4. Сопоставление констант скорости тепловой инактивации и денатурации мААТ. Зависимости высокой чувствительности активного констант скорости инактивации kin (1) и денатурации центра фермента к воздействию kden (2) от температуры в координатах Аррениуса.

Точки на прямой 1 — экспериментальные значения денатурирующих факторов по сравнению с kin. Размерность kin и kden — мин-1.

целой белковой глобулой.

Для объяснения расхождений между скоростями инактивации и денатурации мААТ предложена следующая схема:

(5).

den in ln k (1); ln k (2) В этой схеме Ea, Ein и Eden — активная, инактивированная и денатурированная формы мААТ, соответственно. Предполагается, что инактивация фермента обусловлена локальными структурными изменениями в области активного центра. При этом конформация белковой глобулы остается практически неизменной. Предполагается также, что изменение энтальпии при переходе из активной в инактивированную форму близко к нулю, в то время как энергия активации для реакции Ea Ein достаточно высока.

В рамках данных предположений конформации Ea и Ein сходны, поэтому их разворачивание протекает с одной и той же скоростью. Если прослеживать процесс денатурации, схема (5) эквивалентна одностадийной модели (см. схему (1)). Таким образом, предложенная модель инактивации-денатурации мААТ объясняет более высокую скорость инактивации по сравнению со скоростью денатурации.

Рис. 5 демонстрирует повышение 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 den А интенсивности светорассеяния (I) в ходе тепловой агрегации мААТ в зависимости 60000 от времени инкубации белка при различных температурах. Повышение концентрации белка в интервале от 0,05 до 0 200 400 600 800 t (мин) den 0,4 гм/мл приводит к повышению скорости Б 0.000 0.015 0.030 0.роста интенсивности светорассеяния (кривые 1-4 на рис. 5А-В). При длительных временах инкубации происходит снижение интенсивности светорассеяния, обусловленное преципитацией белковых 0 100 200 300 400 500 t (мин) den В 0.00 0.04 0.08 0.агрегатов.

Интересен тот факт, что восходящая часть кривой зависимости интенсивности светорассеяния (I) от времени (до момента начала преципитации) подчиняется экспоненциальному закону (Kurganov, 0 50 100 150 200 250 t (мин) 2002):

Рис. 5. Тепловая агрегация мААТ (10 мМ Naфосфатный буфер, pH 7.5) Зависимости I = Ilim[1- exp(-kIt)], (6) интенсивности светорассеяния от времени при 55 °С (А), 57,5 °C (Б) и 60 °C (B). Концентрации белка: 0,где Ilim — предельное значение I при t, (1), 0,1 (2), 0,2 (3) и 0,4 (4) мг/мл. Сплошные линии — экспериментальные данные; пунктирные линии kI — константа скорости первого порядка.

рассчитаны по уравнению (6); горизональные пунктирные линии соответствуют значению Ilim.

Применимость данного уравнения для I (фотоотсчет/т) I (фотоотсчет/т) I (фотоотсчет/т) анализа показана на примере кинетических кривых агрегации мААТ, полученных при концентрации фермента 0,4 мг/мл (пунктирные кривые на рис. 5А-В).

На первый взгляд, ход расчетных кривых, описываемых экспоненциальным уравнением, соответствует процессу агрегации, протекающему в условиях отсутствия преципитации. В этом случае значение Ilim должно соответствовать полному переходу белка в агрегированное состояние. Поскольку процесс тепловой денатурации протекает как необратимая мономолекулярная реакция, количество денатурированного белка может быть рассчитано в соответствии со следующим уравнением: den = 1 – exp (-kdent), где kden — константа скорости денатурации. Для расчета значения kden при различных температурах использовано уравнение Аррениуса в следующей форме:

den Ea 1 kden = exp - мин-1, (7) R T1den T den где Ea — энергия активации, T1den — температура, при которой константа скорости kden den равна 1 мин-1 и R — универсальная газовая постоянная. Значения параметров Ea и T1den приняты равными 516,6 ± 0,7 кДж моль-1 и 346,44 ± 0,01 К соответственно (10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5). Значения kden при 55 °С (А), 57,5 °С (Б) and 60 °С (В) рассчитаны по уравнению (7) и составляли 2,710-5, 1,210-4 и 5,110-4 мин-1, соответственно. Верхняя шкала на рис. 5А-В показывает долю денатурированного белка (den) в ходе денатурации мААТ при соответствующих температурах. Для характеристики скорости прироста светорассеяния, предлагается использовать параметр t0,99 (t0,99 — значения времени, при котором интенсивность светорассеяния достигает уровня I/I = 0,99). Значения параметра t0,99 зависимости интенсивности светорассеяния от времени рассчитаны по уравнению (4) при 55 °С (А), 57,5 °C (Б) и 60 °С (В) и получились равными 660, 860 и 245 мин, соответственно. Эти значения t0.99 соответствовали следующим значениям den: 0,018, 0,097 и 0,117. Таким образом, прекращение прироста интенсивности светорассеяния имеет место при временах, когда количество денатурированного белка не достигает даже 10%. Специальными опытами показано, что количество агрегированного белка (agg), рассчитанное на основании измерения оптической плотности растворов белка после 30-минутного центрифугирования при 20 000g, совпадает с количеством денатурированного белка (agg = den).

Измерение гидродинамического радиуса (Rh) белковых агрегатов, образующихся в ходе тепловой агрегации мААТ, позволило объяснить причину преципитации агрегатов при низких значениях степени денатурации. Обработка данных динамического светорассеяния показала, что распределение белковых агрегатов по размерам в ходе тепловой 0.агрегации мААТ остается унимодальным, причем с увеличением времени инкубации пик распределения 0.сдвигается в область больших значений Rh. На рис. 6 показано типичное 0.распределение белковых агрегатов мААТ по размерам при различных временах 0.инкубации при 60 °С.

101 102 103 Rh (нм) На рис. 7 представлена Рис. 6. Типичное распределение белковых агрегатов мААТ (0,2 мг/мл) по размерам при различных зависимость величины гидродивременах инкубации при 60 °С.

намического радиуса агрегатов от времени для агрегации мААТ при 60 °С.

Аналогичные зависимости были получены при температурах 55 и 57,5 °С.

Как видно на рисунке, процесс агрегации сопровождается монотонным увеличением Rh, который достигает значений ~2000 нм. При достижении этих 0 50 100 150 значений Rh начинается преципитация.

t (мин) Рис. 7. Зависимость гидродинамического радиуса Для характеристики ширины белковых агрегатов от времени при агрегации мААТ распределения белковых агрегатов по при 60 °С. Концентрации белка: 0,05 (1), 0,1 (2), 0,(3) и 0,4 (4) мг/мл.

размерам был рассчитан индекс полидисперсности (PI). На рис. 8 показан 0.типичный характер изменений величины 0.PI с течением времени при агрегации 0.мААТ (0,2 мг/мл) при 60 °С. Начальное повышение значения PI сменяется его 0.экспоненциальным снижением.

0.Предельное значение PI при t было 0.рассчитано равным 0,14 ± 0,01.

0 50 100 150 t (мин) Полученное низкое значение PI Рис. 8. Изменение индекса полидисперсности (PI) во характерно для агрегации коллоидных времени в процессе агрегации мААТ (0,2 мг/мл) при частиц, протекающей в диффузионно60 °C.

контролируемом режиме (Weitz, 1985).

Относительная интенсивность h R (нм) PI Перед тем как анализировать зависимость Rh(t), нами были построены графики соотношения между величинами I и Rh (рис. 9). Начальные участки таких графиков линейны и описываются уравнением:

I = I2(Rh – Rh,0), (8) 4 3 где Rh,0 — гидродинамический радиус стартовых агрегатов, I2 — константа. Rh,соответствует отрезку, отсекаемому на оси абсцисс линейной зависимостью I (Rh).

Значения параметров I2 и Rh,0 рассчитаны при различных концентрациях мААТ и 0 200 400 600 различных температурах инкубации Rh (нм) (таблица 1). Как следует из полученных Рис. 9. Соотношение между интенсивностью светорассеяния и величиной гидродинамического данных, изменение температуры или радиуса белковых агрегатов для агрегации мААТ при 60 °С. Концентрации белка: 0,05 (1), 0,1 (2), 0,2 (3) и концентрации белка не приводит к 0,4 (4) мг/мл.

заметным изменениям величины Rh,0, среднее значение которой составляет 78,5 ± 1,0 нм.

Зная значение Rh,0, мы провели анализ начальных участков зависимостей Rh(t).

Значения параметра 1/t2R, характеризующие скорость агрегации, приведены в таблице 1.

1/t2R растет с увеличением температуры или концентрации белка.

При значениях времени выше определенной величины (t > t*) зависимость Rh(t) подчиняется степенной функции 1/ df * Rh = Rh 1+ K2 t - t* (9) ( ) * со значением фрактальной размерности агрегатов df, близкой к 1,8 (значения t*, Rh и df даны в таблице 1). Такой характер зависимости Rh от времени указывает на то, что агрегация мААТ протекает в режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении равна единице (diffusion-limited cluster-cluster aggregation, DLCA), то есть скорость агрегации ограничивается лишь диффузией частиц (Markossian et al., 2006;

Khanova et al., 2007; Meremyanin et al., 2008;).

I (фотоотсчет/с) Таблица 1. Параметры уравнений (4), (8), (9), использованных для описания кинетики агрегации мААТ (мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5) Темпера- (мAAT) Rh,0 (нм) t* (мин) Rh* (нм) df I210-3 (1/t2R) тура (°C) (мг/мл) ((фотоотсчет/с)/ 102 (мин-1) нм) 55 0,05 100 0,94 ± 0,02 79,2 ± 0,9 5,2 ± 0,1 1,88 ± 0,55 0,1 100 2,0 ± 0,1 76,2 ± 1,2 4,8 ± 0,1 1,86 ± 0,55 0,2 60 4,9 ± 0,2 71,3 ± 1,4 8,1 ± 0,2 1,85 ± 0,55 0,4 30 7,9 ± 0,2 72,6 ± 1,3 11,2 ± 0,3 1,84 ± 0,57,5 0,05 55 4,9 ± 0,2 85,9 ± 1,4 9,8 ± 0,2 1,76 ± 0,57,5 0,1 50 6,7 ± 0,1 81,9 ± 1,0 8,9 ± 0,2 1,81 ± 0,57,5 0,2 40 11,1 ± 0,1 84,4 ± 0,6 13,3 ± 0,3 1,87 ± 0,57,5 0,4 40 17,9 ± 0,5 72,6 ± 1,1 12,7 ± 0,2 1,80 ± 0,60 0,05 15 3,1 ± 0,1 76,9 ± 0,8 20 ± 1 1,84 ± 0,60 0,1 15 3,7 ± 0,2 81,0 ± 1,4 24 ± 1 1,84 ± 0,60 0,2 15 5,4 ± 0,2 75,9 ± 0,7 32 ± 2 1,80 ± 0,60 0,4 15 9,7 ± 0,2 83,8 ± 0,9 50 ± 3 1,81 ± 0,2. Влияние -кристаллина на тепловую агрегацию мААТ В настоящей работе исследовано влияние -кристаллина (олигомерного, полидисперсного белка с молекулярной массой 660-940 кДа) на тепловую агрегацию мААТ. На рис. 10 показаны зависимости интенсивности светорассеяния от времени для агрегации мААТ (0,2 мг/мл) в присутствии -кристаллина. Прирост интенсивности светорассеяния при агрегации в присутствии -кристаллина снижается. Практически полное подавление агрегации мААТ наблюдается при концентрации -кристаллина, равной 0,4 мг/мл (рис. 10, кривая 5).

Анализ распределения агрегатов 100000 мААТ по величине гидродинамического радиуса показал, что в присутствии -кристаллина при длительных временах 0 100 200 300 400 t (мин) инкубации унимодальное распределение Рис. 10. Подавление агрегации мААТ переходит в бимодальное. Типичный пример -кристаллином. Зависимости интенсивности светорассеяния от времени для агрегации мААТ (0,такого распределения агрегатов мААТ мг/мл) при 60 °С. Концентрации -кристаллина: 0 (1), 0,1 (2), 0,15 (3), 0,2 (4) и 0,4 (5) мг/мл.

(0,2 мг/мл, 60 °С) представлен на рис. 11.

На рис. 12 представлены зависимости величины гидродинамического радиуса от времени при агрегации мААТ в присутствии различных концентраций -кристаллина I (фотоотсчет/с) (60 °С). Характерной особенностью этих А 0.зависимостей является то, что их начальные участки описываются экспоненциальной 0.функцией:

0. ln Rh = Rh,0exp t - t0, (10) ( ) t2R 0.где Rh,0 — размер стартовых агрегатов, t0 — 0.длительность лаг-периода и t2R — интервал Б 101 102 103 0.времени, на протяжении которого величина Rh удваивается.

0.Для определения величины Rh,0 были 0.использованы графики соотношения между интенсивностью светорассеяния и величиной 0.гидродинамического радиуса белковых 0.В агрегатов. Начальные участки этих графиков 101 102 103 0.линейны, и длина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс прямой линией, определяет 0.величину Rh,0. Гидродинамический радиус 0.первичных агрегатов (Rh,0), значительно 0.1 меньше в том случае, когда агрегация протекает в присутствии -кристаллина 0.Г 101 102 103 (таблица 2). При использовании 0.-кристаллина в концентрациях 0.0,1-0,4 мг/мл величины Rh,0 практически одинаковы и их среднее значение составляет 0.17,7 ± 1,3 нм.

0.Зная величину Rh,0, мы провели анализ зависимостей величины гидродинамического 0.101 102 103 Rh (нм) радиуса от времени для агрегации мААТ в Рис. 11. Распределение частиц мААТ (0,2мг/мл) по присутствии -кристаллина в величине гидродинамического радиуса в присутствии -кристаллина (0,2 мг/мл). Времена концентрациях 0,1, 0,15 и 0,2 мг/мл. Как инкубации: 100 (А), 200 (Б), 300 (В) и 350 (Г) мин.

Pages:     ||
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.