WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     |
|

На правах рукописи

ГОЛУБ Николай Викторович ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТЕПЛОВОЙ АГРЕГАЦИИ ГЛОБУЛЯРНЫХ ОЛИГОМЕРНЫХ БЕЛКОВ 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2008

Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук К.А. Маркосян

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук С.С. Шишкин кандидат биологических наук Л.В. Белоусова

Ведущая организация:

ГОУП ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится 11 декабря 2008 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неблагоприятные условия в клетках (например, тепловой шок) могут приводить к разворачиванию и агрегации белков. Накопление агрегированных белков сопровождается образованием нерастворимых внутриклеточных структур. Проблему агрегации белков необходимо учитывать при решении биотехнологических задач, в частности, при ренатурации рекомбинантных белков в нативную форму из телец включения.

Содержание таких белков, как аспартатаминотрансфераза (L-аспартат-2оксоглутаратаминотрасфераза, КФ 2.6.1.1, ААТ) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД; КФ 1.2.1.12), в клетках животных очень высоко. ААТ, пиридоксальфосфатзависимый фермент, участвует в метаболизме азота в клетках, катализируя обратимый перенос аминогруппы с L-аспарагиновой кислоты на 2-кетоглутаровую кислоту с образованием щавелевоуксусной и L-глутаминовой кислот. Митохондриальная аспартатаминотрансфераза (мААТ) - димер с молекулярной массой 90 кДа, образованный двумя идентичными субъединицами. ГАФД, NAD+-зависимый фермент, катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фофата в 1,3-дифосфоглицерат. ГАФД - тетрамерный фермент с молекулярной массой 144 кДа, состоящий из идентичных субъединиц. Среди большого ряда алкогольдегидрогеназ (АДГ) наиболее широко распространены цинк-содержащие ферменты. Эта группа ферментов встречается в клетках прокариот и эукариот.

Алкогольдегидрогеназа I (АДГ I) из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (алкоголь : NAD+ оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.1) - тетрамерный фермент (150 кДа), состоящий из идентичных субъединиц, каждая из которых содержит по два иона Zn2+. Изучение механизмов агрегации этих белков, различающихся функцией, структурой, тканевой и внутриклеточной локализацией, представляется очень важным.

В ответ на стресс (тепловой, окислительный или токсический) в клетках прокариот и эукариот синтезируются белки теплового шока «heat shock proteins (Hsps)», играющие роль молекулярных шаперонов. Функции шаперонов состоят в том что они взаимодействуют с развернутыми полипептидными цепями, предотвращая их необратимую агрегацию, участвуют в фолдинге и сборке белков и предохраняют клетки от вызываемых стрессом повреждений. -Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока (shsps), обладает антиагрегационной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет агрегацию развернутых форм белков. В работах Е.А. Хановой с соавторами (Khanova et al., 2005) и А.В. Меремьянина с соавторами (Meremyanin et al., 2008) показано, что подавление агрегации белков -кристаллином обусловлено переходом процесса агрегации из диффузионно-контролируемого режима в кинетический режим, для которого вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы. Это показано на примере подавления тепловой агрегации ГАФД и гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и L-кристаллина. Представляло интерес выяснить, выполняется ли подобный механизм защитного действия -кристаллина для других белковых субстратов и насколько он общий.

GroEL, представитель семейства шаперонинов 60, в клетках участвует в фолдинге белков. Известно, что GroEL проявляет способность подавлять агрегацию белковых субстратов, однако, механизм защитного действия GroEL оставался невыясненным.

Поскольку способность взаимодействовать с развернутой формой белков проявляют шапероны различных классов, актуальным является проведение сравнительных исследований механизмов защитного действия различных шаперонов.

Цель работы. Целью настоящей работы является выявление кинетических закономерностей и механизма тепловой агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов, в отсутствие и в присутствии шаперонов, взаимодействующих с развернутыми формами белков. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. изучить кинетику тепловой инактивации, денатурации и агрегации митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) из сердца свиньи;

2. для получения более детальной информации о начальной стадии процесса тепловой агрегации белков подобрать условия агрегации глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика, при которых возможна одновременная регистрация исходной (нативной) формы белка и белковых агрегатов;

3. с использованием в качестве белковых субстратов мААТ и ГАФД изучить влияние -кристаллина, представителя семейства малых белков теплового шока, и GroEL, представителя семейства шаперонинов 60, на тепловую агрегацию белков;

4. проверить наличие шапероноподобной активности у дрожжевой алкогольдегидрогеназы I с использованием тест-системы, основанной на агрегации УФ-облученного -кристаллина при 37 °С.

Научная новизна. На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации мААТ сделан вывод о том, что инактивация фермента характеризуется более высокой скоростью по сравнению со скоростью денатурации белка. Это указывает на более высокую чувствительность активного центра фермента к денатурирующим воздействиям по сравнению с целой белковой глобулой. Установлено, что тепловая агрегация мААТ протекает в диффузионно-контролируемом режиме.

Подобраны условия агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которые позволили доказать, что образование стартовых агрегатов из денатурированных молекул белка происходит по принципу «все-или-ничего», без образования интермедиатов.

Проведено сравнение механизмов подавления агрегации белков -кристаллином и GroEL — белками, относящимися к различным классам шаперонов. Установлено, что -кристаллин и GroEL препятствуют агрегации белков (мААТ и ГАФД) путем изменения кинетики агрегации из диффузионно-контролируемого режима в режим агрегации, характеризующийся вероятностью слипания частиц при столкновении, меньшей, чем единица.

Показано, что необычная кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I, проявляющаяся в экспоненциальной зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени, объясняется наличием шапероноподобной активности у нативного фермента.

Практическое значение работы. Понимание механизма агрегации белков позволяет предложить количественные методы оценки скорости агрегации, которые могут быть использованы для отбора агентов, эффективно подавляющих агрегацию белков.

Понимание механизма защитного действия шаперонов различных классов может служить основой для поиска антиагрегационных агентов, которые, подобно шаперонам, будут оказывать защитное действие путем уменьшения вероятности слипания сталкивающихся частиц. Агенты подобного рода могут найти применение при решении биотехнологических задач и при создании препаратов медицинского назначения.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на ХIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов— 2006» (Москва, 2006), III Международном симпозиуме "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Дубна, 2007), 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (Будапешт, Венгрия, 2007), на конкурсе аспирантов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на соискание стипендии имени члена корреспондента РАН В.Л. Кретовича (Москва, 2008). Присужден грант в области естественных и гуманитарных наук по программе «Лучшие аспиранты РАН» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей в рецензируемых журналах, 2 статьи в сборниках трудов и тезисы сообщений на 3-х конференциях).

Объем и структура работы. Работа изложена на _страницах, содержит рисунков и таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (глав), выводов и списка цитируемой литературы (_источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ААТ из митохондрий сердца свиньи была любезно предоставлена к.б.н.

М.В. Шолухом (научно-исследовательская лаборатория биохимии обмена веществ биологического факультета Белорусского государственного университета), ГАФД из мышц кролика была любезно предоставлена к.б.н. Р.А. Асриянц (отдел биохимии животной клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им.

А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова).

Лиофилизованный препарат дрожжевой АДГ I («Sigma», США), содержащий по данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) примесь термолабильной формы фермента, прогревали при 52 °C в течение 13 мин. При повторном сканировании прогретого образца на кривой теплопоглощения ДСК получали один пик. Кристаллины (- и L-) из хрусталиков глаза телят были любезно предоставлены к.б.н. К.О. Мурановым (лаборатория физико-химических основ биорегуляции Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН). GroEL был любезно предоставлен проф. В.И. Муронцом (отдел биохимии животной клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В.

Ломоносова). Степень чистоты белков, используемых в работе, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

Калориметрические исследования проводили в лаборатории молекулярной организации биологических структур совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) и к.б.н. В.Н. Орловым (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «ДАСМ-4М» (Биоприбор, Россия) при постоянном избыточном давлении 2,2 атм. со скоростью нагревания 1 К/мин.

Обратимость теплового перехода проверяли путем сравнения остаточной теплоемкости при повторном прогреве образца.

Кинетику агрегации белков изучали методом динамического светорассеяния.

Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 нм, 10 мВ) в качестве источника света. Температуру образцов поддерживали при помощи PID temperature controller в пределах ±0,1 °C. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени.

Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Тепловая инактивация, денатурация и агрегация мААТ Тепловую денатурацию митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) изучали методом ДСК. Растворы белка нагревали с постоянной скоростью 1 К/мин в ex температурном интервале от 10 до 90 °С. Зависимости избыточной теплоемкости (Cp ) от температуры, полученные при различных концентрациях белка, представлены на рис. 1.

Положение максимума (Тmax) остается неизменным при варьировании концентрации мААТ от 0,2 до 3,2 мг/мл. Это указывает на то, что кинетическая схема процесса денатурации не содержит кинетически 200 значимой стадии обратимой диссоциации димера мААТ на мономеры (Любарев и 60 70 Температура (°С) др., 2000; Lubarev et al., 2001).

На рис. 2 представлены температурные зависимости избыточной теплое40 50 60 70 мкости, полученные при различных Температура (°С) Рис. 1. Тепловая денатурация мААТ (10 мМ Naскоростях сканирования (v = 0,25; 0,5; 1,0 и ex фосфатный буфер, pH 7,5). Зависимости Cp от 2,0 К/мин). Положение максимума температуры, полученные при различных концентрациях фермента: 0,2 (1), 1,0 (2) и 3,2 мг/мл профилей ДСК сдвигается от 69,7 до (3). Скорость сканирования 1 К/мин. Вставка — температурный профиль при концентрации мААТ 3,2 73,1 °С при повышении скорости мг/мл. Точки — экспериментальные данные; сплошсканирования от 0,25 до 2,0 К/мин.

ная кривая рассчитана при помощи системы уравнений (2).

ex p C (кДж/моль * К) ex p C (кДж/моль * К) Температурные профили избыточной 600 теплоемкости проанализированы в предположении, что денатурация белка протекает как необратимая реакция первого порядка:

den N k D (1), где N и D — нативный и денатурированный белок, соответственно, и kden — константа 60 65 70 Температура (°C) скорости денатурации. Для описания ex Рис. 2. Количественный анализ зависимостей Cp при ex зависимости Cp от температуры концентрации мААТ 1,5 мг/мл, полученных при различных скоростях сканирования: (1) 0,25, (2) 0,5, использовали систему уравнений (Kurganov (3) 1,0 и (4) 2,0 К/мин. Точки — экспериментальные данные; сплошные кривые рассчитаны по уравнениям et al., 1997; Lyubarev et al., 1999):

(2) и (3) при значениях параметров:

den Ea = 516,6 кДж/моль и T1den = 346,44 К.

dnat kdennat = А dT v, (2) ex 0.Cp = Qt kdennat v -0.2 где nat — доля нативного белка, kden — константа скорости денатурации, T — -0.абсолютная температура, v — скорость повышения температуры, Qt — общая тепло-0.та денатурации. Предполагается, что зависимость kden от температуры Б подчиняется уравнению Аррениуса:

Pages:     |
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.