WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Рисунок 3. Влияние альфа-токоферола (30 мкМ) на размер колоний (слева) и морфологию митохондрий (справа) дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

3.3 Метакаспаза Yса1 вовлечена в проявление токсичности мутантного хантингтина Одним из ключевых клеточных событий, сопровождающих программированную гибель, является активация каспаз. Было показано, что дрожжевая метакаспаза Yca1 играет важную роль в индукции каскада апоптоза у дрожжей, вызванного различными факторами (Madeo et al., 2002). В нашей модели нарушение гена дрожжевой метакаспазы YCA1 приводило к изменению внутриклеточной локализации агрегатов хантингтина. Появление включений, образованных хантингтином с удлиненным полиглутаминовым доменом, в ядре практически не происходило в клетках, лишенных гена дрожжевой метакаспазы YCA1 (рис. 4). При этом существенно увеличилась выживаемость и колониеобразующие свойства клеток, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (рис. 5).

Рисунок 4. Влияние дрожжевой метакаспазы Yса1 на внутриклеточную локализацию мутантного хантингтина. Показана степень ко-локализации ядерного ДНК-сигнала и 103QCFP-сигнала. В клетках с нарушенным геном дрожжевой метакаспазы YCA1 эти сигналы практически не перекрываются.

Рисунок 5. Влияние дрожжевой метакаспазы Yca1 на колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (суток, галактоза).

Тем самым была подтверждена гипотеза о том, что токсичность хантингтина непосредственно связана с его накоплением в ядре, а также о том, что гибель клеток при экспрессии мутантного хантингтина является запрограммированной.

Одним из способов определить степень повреждения клетки является оценка уровня карбонилированных белков. Карбонилирование представляет собой химическое взаимодействие белков с альдегидами и ведет к потере функциональных свойств и деградации белка. Было установлено, что уровень карбонилирования у штамма, экспрессирующего удлиненный полиглутаминовый фрагмент, несколько выше, чем у контрольного штамма, при этом нарушение гена дрожжевой метакаспазы не оказывало существенного влияния на количество карбонилированных белков в клетке (данные не показаны).

3.4 Поиск генов, потенциально вовлеченных в проявление токсичности мутантного хантингтина В ходе дальнейшего изучения механизмов программированной клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина, был проведен генетический скрининг. Мы рассчитывали обнаружить другие гены, нарушение которых будет снижать чувствительность дрожжей к экспрессии хантингтина. Для этого штамм W3031A 103Q мы трансформировали транспозоном, который замещал случайный участок последовательности геномной ДНК, и полученную смесь мутантов высевали на твердую среду, содержащую галактозу для индукции экспрессии.

Затем отбирали наиболее крупные колонии и подвергали их повторной проверке на способность быстро расти на среде, содержащей галактозу, и на наличие конструкции с хантингтином. В конечном итоге мы получили ряд мутантных штаммов, имеющих такой же фенотип (по скорости роста и морфологии клеток), как и у дрожжей, экспрессирующих хантингтин с нормальным полиглутаминовым фрагментом (25Q-CFP). При этом клетки сохранили способность экспрессировать хантингтин с удлиненным полиглутаминовым фрагментом (103Q-СFP), который образует агрегаты в цитоплазме и ядре (рис. 6).

Рисунок 6. Морфология клеток, экспрессирующих полиглутаминовый фрагмент хантингтина, и флуоресценция CFP, связанного с полиглутаминовым фрагментом.

Это доказывает, что увеличение скорости роста на среде с галактозой этих штаммов достигалось не за счет репрессии синтеза полиглутаминового фрагмента или ускорения скорости его деградации. Это дает нам основание полагать, что идентифицированные гены (список и краткая характеристика см.

табл. 1) играют роль в каком-либо активном процессе, усиливающем токсический эффект полиглутаминовых фрагментов, например, активации каскада программируемой клеточной смерти. Интересно, что некоторые из этих генов оказались вовлечены в регуляцию клеточного цикла и МАР-киназный каскад. Обсуждение роли каждого конкретного гена, обнаруженного в результате скрининга, выходит за рамки работы. Для наиболее заинтересовавших нас генов PTP2, NPT1, ASE1, VPS36, TUS1, ICY1 были получены мутанты с полностью инактивированным геном, экспрессирующие удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина. Мы проверили, как инактивация некоторых генов, полученных в ходе скрининга, влияет на выживаемость дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

Таблица 1. Краткая характеристика генов, идентифицированных в ходе скрининга.

Краткое описание продукта этого гена (на Открытая рамка Название гена основании данных доступных из базы данных считывания YeastGenomeDatabase, Stanford), комментарии Тирозиновая фосфатаза. Локализована в ядре.

PTP2 YOR208W Участвует в инактивации MAP-киназ в ответ на изменение осмотического давления на клетку.

Никотинатфосфорибозилтрансфераза.

NPT1 YOR209C Локализована в ядре. Участвует в биосинтезе НАД+, регулирует сайленсинг ДНК, кодирующих рибосомальную РНК, теломер, и МАТ локуса.

Незаменимый белок, необходимый для биогенеза SOF1 YLL011W 40S субъединицы рибосомы. Полная инактивация этого гена летальна.

Регулирует удлинение веретена в анафазе.

ASE1 YOR058C Подвержен деградации с помощью APC.

Возможный субстрат для Cdc28p.

Транскрипционный фактор, ответственный за KAR4 YCL055W феромонный ответ. Также необходим для протекания мейоза.

Кофилин. Актин-связывающий белок.

COF1 COFСтимулирует деполяризацию актина.

Регулятор транскрипции, ответственный за REP1 R0020C копийность плазмид.

Цитоплазматическая протеинкиназа, гомолог SCY1 YMR216C киназы родопсина многоклеточных.

Компонент ESCRT-II комплекса. Участвует в VPS36 YLR417W убиквитин-зависимом сортинге белков в эндосомы.

Хитин синтетаза. Необходима для восстановления CHS1 YNL192W хитиновой септы после цитокинеза. Транскрипция активируется половым феромоном.

Краткое описание продукта этого гена (на Открытая рамка Название гена основании данных доступных из базы данных считывания YeastGenomeDatabase, Stanford), комментарии ARF2 YDL137W Фактор АДФ-рибозилирования. Участвует в везикулярном транспорте.

Фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, TUS1 YLR425W модулятор Rho1p как компонента каскада поддержки клеточной целостности.

ICY1 YMR195W Белок с неизвестной функцией.

PRY3 YJL078C Белок с неизвестной функцией.

YDL133W YDL133W Белок с неизвестной функцией Штаммы с полностью нарушенными генами PTP2 и NPT1 росли несколько медленнее, чем контроль, как на среде, содержащей галактозу, так и в условиях отсутствия экспрессии полиглутаминового фрагмента, что свидетельствует о необходимости этих генов для нормальной жизнедеятельности клетки. Штаммы с полностью нарушенными генами VPS36, TUS1 и ICY1, в которых также экспрессировали мутантный фрагмент хантингтина, показывали высокую степень выживаемости по сравнению с контрольным штаммом W303-1A ade2 103Q как по размеру колоний и количеству КОЕ на твердой среде, так и по соотношению оптической плотности в жидкой среде, содержащей галактозу. Однако было установлено, что устойчивость клеток в этих случаях достигается, по всей видимости, за счет активного выведения конструкции с полиглутамином за пределы ядра и клетки в целом. В то же время штамм с полностью инактивированным геном ASEоказался устойчивым к экспрессии мутантного хантингтина, не теряя при этом конструкцию. Этот штамм показывал большую, чем в контроле, скорость удвоения на жидкой среде, содержащей галактозу, а также лучшую выживаемость и колониеобразующую способность на твердой среде (рис. 7).

Рисунок 7. Влияние гена ASE1 на колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

Ген ASE1 кодирует белок митотического веретена, который является субстратом АРС-комплекса (циклосомы) – основного регулятора клеточного цикла. Главная активность этого ферментативного комплекса – убиквитинилирование циклинов, что опосредует их последующую деградацию протеасомой (Juang et al., 1997; Schuyler, Liu, and Pellman, 2003). Мы предполагаем, что экспрессированный в дрожжах мутантный хантингтин перегружает протеасому, что замедляет протеолиз циклинов и таким образом тормозит фазу деления клеточного цикла. Возможно, инактивация гена ASEуменьшает загруженность АРС-комплекса, таким образом ускоряя деградацию циклинов в клетках, экспрессирующих мутантный хантингтин.

Это согласуется с данными, полученными в нашей лаборатории, которые свидетельствуют о том, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина частично спасает дрожжевые клетки от гиперактивации АРС (Sokolov et al., 2006). Было показано, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина приводит к нарушениям клеточного цикла. Предположили, что экспрессия 103Q ингибирует АРСкомплекс, таким образом препятствуя выходу из митоза. Чтобы проверить это предположение, в клетках проэкспрессировали ген СDC20, кодирующий субъединицу АРС-комплекса, под галактозным промотором. Клетки со сверхэкспрессией Cdc20 не могли расти на среде с галактозой, потому что АРСкомплекс индуцировал арест в G1 фазе клеточного цикла. Однако экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина (в отличие от фрагмента нормальной длины) позволяла этим клеткам расти и формировать микроколонии (рис. 8). Поэтому был сделан вывод, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина задерживает клетки в митотической фазе деления.

Рисунок 8. Экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина (103Q) снижает токсический эффект сверхэкспрессии субъединицы АРС-комплекса Cdc20.

Если увеличить активность работы АРС-комплекса или нейтрализовать избыток циклинов, можно будет избежать перегрузки протеасомы, вызванной образованием агрегатов хантингтина. Для проверки этого предположения были получены мутантные штаммы W303-1A 103Q clb2, W303-1A 103Q CDH1, W303-1A 103Q yca1 CDH1.

Было установлено, что гиперэкспрессия гена CDH1, являющегося активатором АРС-комплекса, и нарушение гена CLB2, кодирующего циклин В, также повышали выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих мутантный фрагмент хантингтина (рис. 9 и 10). При этом клетки практически не теряли конструкцию 103Q-CFP (данные не показаны) и показывали приблизительно одинаковый уровень экспрессии полиглутаминового фрагмента (рис. 11 и 12). Таким образом, мы получили свидетельства в пользу нашей гипотезы о том, что экспрессия мутантного полиглутаминового фрагмента хантингтина ведет к перегрузке протеасомы, что в свою очередь приводит к накоплению субстратов АРС-комплекса, замедлению протеолиза циклинов и, как следствие, задержкам клеточного цикла и гибели клеток.

Рисунок 9. Влияние генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, на колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих мутантный хантингтин (YPRafGal, 24 часа).

Рисунок 10. Отношение размера колоний штаммов в условиях экспрессии полиглутаминового фрагмента к размеру колоний при отсутствии экспрессии, %.

Рисунок 11. Оценка уровня экспрессии полиглутаминового фрагмента с помощью белкового электрофореза в ПААГ Рисунок 12. Оценка уровня экспрессии полиглутаминового фрагмента с помощью дотблоттинга.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании полученных данных мы предлагаем следующую схему событий, вызываемых экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах (рис. 13). Мутантный хантингтин накапливается в ядре и взаимодействует с белками, содержащими полиглутаминовые домены, в частности, транскрипционными факторами и эндоцитозными белками, способствуя их инактивации. Помимо этого, экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента в дрожжах перегружает убиквитинпротеасомный комплекс, что замедляет протеолиз циклинов и таким образом тормозит фазу деления клеточного цикла. В конечном итоге эти события приводят к клеточной гибели, сопровождающейся некоторыми маркерами апоптоза.

Считается, что основная роль дрожжевой метакаспазы – участие в программируемой гибели клеток. Однако в последнее время появляются свидетельства того, что ген YCA1 может быть также вовлечен в неапоптотические события, например, в регуляцию G2/M чекпоинта клеточного цикла (Lee at al,, 2008). Возможно, участие в гибели клеток, вызванной экспрессией мутантного полиглутаминового фрагмента хантингтина, генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, и дрожжевой метакаспазы не является независимым друг от друга, о чем косвенно свидетельствуют результаты, полученные в данной работе.

Мутация в гене, кодирующем хантингтин Неправильно свернутый белок Перегрузка убиквитин- протеасомного Инактивация комплекса ядерных белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты (факторы Замедление транскрипции, белки протеолиза эндоцитоза) циклинов Нарушение клеточного цикла Гибель клеток Рисунок 13. Предполагаемая схема событий, происходящих в клетках при экспрессии хантингтина с удлиненным полиглутаминовым фрагментом.

Мы считаем, что влияние мутантного полиглутаминового фрагмента хантингтина на компоненты клеточного цикла имеет важное значение не только для дрожжевой модели болезни Хантингтона. Известно, что циклины – не единственные субстраты АРС-комплекса. Было показано, что деградация факторов дифференцировки нейронов Id2 (Lasorella et al., 2006) и SnoN (Stegmller et al., 2006) катализируется АРС/C(CDH1). Также имеются данные о том, что белок Cdh1 необходим для нормального функционирования мозга, в частности, процессов, связанных с памятью и обучаемостью (Li at al,, 2008).

Мы предполагаем, что в нейронах удлиненные полиглутамины могут привести к патологическому накоплению Id2 и SnoN. Если это предположение окажется верным, то белки Cdh1, Id2 и SnoN станут потенциальными мишенями при лечении полиглутамин-зависимых заболеваний.

5.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1. Токсичность удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина коррелирует с его накоплением в ядре, что подтверждает гипотезу об инактивации транскрипционных факторов и других полиглутаминсодержащих ядерных белков.

2. Экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в клетках дрожжей сопровождается признаками программированной клеточной гибели. В тоже время нарушение гена дрожжевой метакаспазы YCA1 влияет на локализацию агрегатов полиглутаминового фрагмента хантингтина и снижает его токсичность для клеток.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»