WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

БОЧАРОВА Наталья Александровна Исследование причин токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах Saccharomyces cerevisiae 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008 3

Работа выполнена в лаборатории программируемой смерти одноклеточных эукариот Научно-Исследовательского Института Физико-Химической Биологии имени А.Н. Белозерского при Московском Государственном Университете имени М. В. Ломоносова.

Научный консультант: академик РАН, доктор биологических наук, профессор Скулачев Владимир Петрович Официальные доктор биологических наук, оппоненты: профессор Звягильская Рената Александровна доктор биологических наук, профессор Калебина Татьяна Сергеевна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное унитарное предприятие Государственный научный центр Российской Федерации Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»)

Защита состоится « 11 » _ 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 1.

Автореферат разослан « » 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Существует целый класс заболеваний человека, которые вызваны дисфункцией или гибелью клеток нервной системы. Эти заболевания, называемые нейродегенеративными, проявляются в нарушении функций организма, связанных с деятельностью головного мозга. Появление внутриклеточных белковых агрегатов является общим свойством многих нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (Taylor et al., 2002). До сих пор неясно, является ли образование таких агрегатов ключевым фактором, необходимым для развития патологического процесса, или же оно представляет собой клеточный ответ, направленный на противодействие накоплению неправильно собранных белков.

Агрегация и токсичность полиглутаминов в настоящее время широко исследуется на различных клеточных культурах и организмах. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются весьма удобной в экспериментальном плане моделью для изучения заболеваний, связанных с образованием белковых агрегатов, в частности, болезни Хантингтона (Outeiro and Giorgini, 2006).

Первая дрожжевая модель для изучения патофизиологических эффектов хантингтина была предложена в 2002 году: было показано, что экспрессия Nконцевой части удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae приводит к замедлению роста, нарушению клеточного цикла, образованию агрегатов в цитоплазме и ядре (Meriin et al., 2002).

Одним из главных преимуществ «дрожжевой» модели является возможность проведения скрининга по поиску генов, вовлеченных в развитие патологического процесса, вызванного удлинением полиглутаминового фрагмента хантингтина. Легкость генетических манипуляций позволяет выявить гены, регулирующие продолжительность жизни дрожжей, активирующие клеточные механизмы ответа на стрессовые факторы, и затем использовать полученные результаты для лучшего понимания генной регуляции старения и дегенерации нейронов.

Показано, что клеточные и молекулярные признаки токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина у дрожжей и нейронов во многом схожи (Sokolov et al., 2006), поэтому есть основания полагать, что полученные данные позволят выявить общие закономерности развития патологии и будут способствовать поиску новых методов лечения болезни Хантингтона.

Цель и задачи исследования Целью данной работы было исследование причин токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а также поиск генов, кодирующих белки, которые вовлечены в агрегацию полиглутаминов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Установить патофизиологические последствия экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах.

2. Выяснить, какую роль в проявлении токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина играет дрожжевая метакаспаза Yca1.

3. Провести поиск генов, кодирующих белки, которые участвуют в развитии патологии при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.

4. Определить роль идентифицированных генов в механизме клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.

Научная новизна работы Показано, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина сопровождается некоторыми признаками программированной клеточной гибели: образованием активных форм кислорода (АФК), фрагментацией митохондрий, деградацией ядерной ДНК. При этом нарушение гена дрожжевой метакаспазы влияло как на локализацию полиглутаминовых агрегатов, так и на выживание клеток.

В ходе дрожжевого скрининга установлено, что нарушение гена ASE1, который кодирует белок, являющийся субстратом для АРС-комплекса, снижает токсичность полиглутаминового фрагмента хантингтина. В то же время показано, что гиперэкспрессия гена CDH1, являющегося активатором АРСкомплекса, и нарушение гена CLB2, кодирующего циклин В, также повышает выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих мутантный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

На основании этих данных разработана модель механизма токсичности полиглутаминового фрагмента хантингтина для дрожжей, включающая взаимодействие мутантного хантингтина с ядерными белками – факторами транскрипции, нарушение функционирования убиквитин-протеасомной системы и систем, ответственных за регуляцию клеточного цикла.

Научно-практическая ценность исследования Работа имеет теоретическое значение для понимания механизмов развития патофизиологических процессов в клетках, связанных с агрегацией полиглутаминсодержащих белков. Полученные результаты могут косвенно свидетельствовать о процессах, приводящих к патологии клеток при болезни Хантингтона и других полиглутаминзависимых нейродегенеративных заболеваниях, и, возможно, в дальнейшем могут быть использованы при разработке новых способов лечения таких болезней.

Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите на семинаре Института биохимии имени А.Н. Баха. Материалы диссертации были представлены на XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), 6-й международной конференции по апоптозу дрожжей (Левен, Бельгия, 2008).

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), раздела «Материалы и методы исследования» (6 глав), результатов (7 глав), обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 46 рисунков и таблиц. Список литературы включает 189 работ, из них 183 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы дана общая характеристика наследственных нейродегенеративных заболеваний, детально рассмотрены патогенез и клинические проявления болезни Хантингтона, а также структура и функции белка хантингтина, отвечающего за возникновение заболевания. Обсуждаются основные потенциальные механизмы проявления токсичности хантингтина и роль его агрегации. Дано описание «дрожжевой» модели токсичности полиглутаминов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae W303-1A (дикий тип), W303-1A 25Q (штамм, несущий конструкцию с полиглутаминовым фрагментом нормальной длины, сшитым с циановым флуоресцентным белком), W303-1A 103Q (штамм, несущий конструкцию с удлиненным полиглутаминовым фрагментом, сшитым с циановым флуоресцентным белком). Кроме этого, в ходе работы были получены штаммы, предположительно устойчивые к токсичности полиглутаминов, в том числе W303-1A 103Q yca1, W303-1A 103Q ase1, W303-1A 103Q clb2, W303-1A 103Q CDH1, W303-1A 103Q yca1 CDH1. В работе использовали стандартные методики генетики дрожжей (Sherman, 1986), Дрожжи выращивали на синтетической среде с добавлением требуемых аминокислот или на полных средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу (YPD) или раффинозу (YPRaf), для индукции экспрессии полиглутаминового фрагмента хантингтина добавляли галактозу (YPRafGal).

Для амплификации фрагментов ДНК с помощью ПЦР, для выделения и анализа плазмид и геномной ДНК использовали стандартные протоколы (Maniatis at al., 1982; Sambrook at al,, 1989). Для проведения генетического скрининга штамм W303-1A 103Q трансформировали транспозонной библиотекой, содержащей маркеры LEU и AMP, и высевали на чашки с синтетической средой без лейцина, содержащие раффинозу и галактозу.

Наиболее крупные колонии повторно проверяли на синтетической среде без лейцина и на богатой среде, содержащей раффинозу и галактозу. Таким образом отбирали мутантные линии, способные нормально расти в условиях экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина. Мутанты, экспрессирующие удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина и при этом имеющие морфологию и скорость роста, характерные для здоровых клеток, подвергались дальнейшему анализу с целью установить, какие гены или участки генов были случайным образом нарушены. Для этого из дрожжей выделяли геномную ДНК и расщепляли ее рестриктазой HindIII. В транспозоне содержался единственный сайт для данной рестриктазы, поэтому в результате рестрикции получали смесь фрагментов геномной ДНК, среди которых был фрагмент, содержащий участок транспозона до сайта рестрикции HindIII.

Полученную смесь фрагментов лигировали с плазмидой pBC SK+, предварительно обработанной той же рестриктазой. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки бактерии E. coli линий XL1 Blue или MCметодом электропорации, затем выращивали их на твердой среде с антибиотиками хлорамфениколом и ампициллином. В этих условиях вырастали только те бактерии, в которые была интегрирована плазмида, содержащая фрагмент транспозона и геномной ДНК дрожжей. Из полученных клонов бактерий выделяли плазмидную ДНК и секвенировали ее. Полученные последовательности сравнивали с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST с геномной ДНК дрожжей и идентифицировали гены или участки генов, нарушенные в результате встраивания транспозона.

Наличие экспрессии данной конструкции во всех мутантных штаммах проверяли с помощью методов флуоресцентной микроскопии. Дополнительно уровень экспрессии оценивали с использованием белкового электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, 1979) и окрашивания антителами anti-GFP (иммуноблоттинг), для иммунодетекции использовали ECLTM system (Towbin, 1979). Детекция карбонилированных белков проводилась посредством реакции с 2,4динитрофенилгидразином и окрашивания антителами, для чего использовали OxyblotTM Protein Oxidation Detection Kit (Levine at al., 1994). Дыхание клеток измеряли полярографическим методом с использованием электрода типа Кларка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Экспрессия мутантного хантингтина токсична для дрожжей Экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина (в отличие от фрагмента нормальной длины) является токсичной для клеток дрожжей, что проявлялось в уменьшении размера колоний на твердой среде, содержащей галактозу (рис. 1), а также в снижении скорости удвоения на жидкой среде (рис. 2) и увеличении процентного содержания мертвых клеток.

В течение первых 6 часов контрольный и мутантный штаммы росли с одинаковой скоростью, однако уже через 8-12 часов инкубации мутантный штамм заметно отставал в росте от контроля.

Рисунок 1. Распределение размера колоний штаммов, экспрессирующих нормальный и удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (24 часа, галактоза).

Рисунок 2. Скорость роста штаммов, экспрессирующих нормальный и удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (галактоза, жидкая среда, OD540).

С помощью методов флуоресцентной микроскопии наблюдали за локализацией и агрегацией полиглутаминового фрагмента хантингтина, сшитого с циановым флуоресцентным белком (CFP). В клетках дрожжей, экспрессирующих фрагмент хантингтина, содержащий 25 остатков глутамина (25Q-CFP), CFP был диффузно распределен в цитоплазме. В то же время в клетках, экспрессирующих удлиненный фрагмент хантингтина, содержащий 103 остатка глутамина (103Q-CFP), наблюдали образование агрегатов CFP.

Интересно отметить, что через 6 часов экспрессии эти клеточные включения были преимущественно локализованы в цитоплазме, а на более поздних стадиях экспрессии (после 12 часов) возрастало количество клеток, у которых агрегаты находились в ядре. Таким образом, замечено, что токсичность удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина коррелирует с его накоплением в ядре.

3.2 Антиоксиданты частично снижают токсичность хантингтина В нашей лаборатории было показано, что токсический эффект экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина сопровождался такими признаками программируемой клеточной гибели, как: фрагментация митохондрий, деградация ядерной ДНК, активация каспаз, образование активных форм кислорода (АФК) (Sokolov et al., 2006). Поэтому мы попытались предотвратить гибель клеток, используя антиоксиданты: водорастворимый Nацетилцистеин (50 мМ) и жирорастворимый альфа-токоферол (30 мкМ).

Выживаемость клеток дрожжей, определяемая по количеству КОЕ, при добавлении этих антиоксидантов существенно не увеличилась, однако добавление альфа-токоферола положительно влияло на размер колоний и морфологию митохондрий дрожжей (рис. 3).

При измерении скорости дыхания клеток в присутствии разобщителя (FCCP) не было выявлено существенных отличий для штаммов 25Q и 103Q (данные не показаны). Мы предполагаем, что образование активных форм кислорода происходит на заключительных этапах патологического процесса, а основной вклад в проявление токсичности полиглутаминового фрагмента хантингтина дают другие клеточные события.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»