WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Первая глава содержит литературный обзор, посвященный физикохимическим характеристикам активных форм кислорода и азота, их источникам в организме и роли в процессах жизнедеятельности. Существенное внимание уделено вопросам участия свободных радикалов кислорода и токсичных метаболитов оксида азота в возникновении и развитии повреждений клеток сердечной мышцы при патологическом стрессе, обусловленным нарушениями кислородного обмена в условиях гипоксии и ишемии. Изложены современные представления о механизмах действия адриамицина (доксорубицина) – одного из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов при химиотерапии злокачественных опухолей человека. Показано, что терапевтическое и кардиотоксическое воздействия адриамицина представляют собою единый мультифакторный процесс, обусловленный окислительным стрессом. Проведен анализ современных тенденций способов защиты организма от последствий окислительного стресса, обоснована целесообразность поиска и исследования характеристик митохондриально-направленных антиоксидантов, в молекулах которых сочетались бы положительно заряженные гидрофобные группы и редокс-активные хиноны, такие как убихинон или пластохинон.

Во второй главе представлены методы и материалы исследования. В разделе 2.1. описано получение изолированных митохондрий из сердец крыс линии Wistar по (Hogeboom, 1955), в разделе 2.2. – измерение их дыхательной активности с помощью электрода Кларка на полярографе YSI 53 фирмы Yellow Spring Instruments, Inc. (США), а также с помощью нитроксильного радикала TEMPONE-D-15N (4-оксо-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-D16-1-оксил-15N) на спектрометре ЭПР. Для этого суспензию митохондрий помещали в герметично закрытый стеклянный капилляр при температуре образца ~25°C. В разделах 2.3. и 2.4. описываются методики регистрации и обработки спектров ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре E-109E фирмы Varian (США) при комнатной температуре (~25°C). Образцы помещали в газопроницаемые капилляры PTFE 22 (внутренний диаметр 0.635 мм, толщина стенок 0.051 мм) фирмы Zeus Industrial Products, Inc. (США), а запись спектров проводили либо при непрерывной аэрации образца (газовая среда – воздух), либо в условиях варьируемого парциального давления кислорода. Содержание кислорода в инкубационной смеси определяли по ширине компонент спектра ЭПР TEMPONE-D-15N, а также по ширине синглетного сигнала ЭПР фталоцианина лития (LiPc). Для измерения скорости генерации супероксидных радикалов в митохондриях или в модельных системах в реакционную смесь вводили спиновую ловушку TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия).

Абсолютные значения скорости образования O2•– вычисляли с помощью супероксид-генерирующей системы ксантиноксидаза-ксантин, кинетические характеристики которой определяли по скорости восстановления цитохрома c супероксидными радикалами. Раздел 2.5 посвящен описанию методов получения препаратов динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), используемых в экспериментах по изучению метаболизма оксида азота и баланса прооксидантных и антиоксидантных процессов в клетках миокарда.

Концентрацию ДНКЖ в образцах также определяли с помощью спектроскопии ЭПР. Для этого используемую димерную форму ДНКЖ, не обнаруживаемую методом ЭПР, переводили в мономерную ЭПР-детектируемую форму. В разделе 2.6. описаны методики получения и изучения характеристик семихинонных свободных радикалов – промежуточных продуктов в окислительновосстановительных реакциях биологически значимых хиноидных соединений – производных убихинона или пластохинона. Семихиноны mitoQ (2,3-диметокси5-метил-6-децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон), SkQ1 (2,3-диметил-6децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон), SkQ3 (2,3,5-триметил-6-децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон) и их аналогов образовались в процессе автоокисления соответствующих хинолов в этаноле или в смеси этанол-водный буфер (pH 7,8-8,5). Все экспериментальные спектры свободнорадикальных интермедиатов были симулированы с помощью программы WinEPR SimFonia фирмы Bruker (ФРГ).

Статистическую обработку полученных результатов производили по tтесту и тесту ANOVA. Результаты представлены как среднее значение ± средняя ошибка (M±m). Различия между экспериментальными данными считали достоверными, если P < 0,05.

В третьей главе представлены полученные результаты и их обсуждение.

В разделе 3.1. представлены результаты определения функциональной активности митохондрий. Для этого измеряли скорости потребления кислорода в третьем и четвертом состояниях дыхательной цепи с помощью электрода Кларка, а также с помощью нитроксильного радикала TEMPONE-D-15N на спектрометре ЭПР, ширина линий дублетного спектра которого определяется концентрацией кислорода в реакционной смеси (рис. 1). В наших опытах изолированные митохондрии сердца крысы характеризовались в состояниях и 4 скоростями дыхания 77±9 и 26±5 нмоль O2/мин/мг белка, Рис. 1. Зависимость ширины низкопольной соответственно (при 25°C), т.е.

компоненты спектра ЭПР нитроксильного имели дыхательный контроль по радикала TEMPONE-D-15N в суспензии митохондрий сердца крысы от времени ADP, равный по значению четырем.

инкубации. Суспензия митохондрий находилась в закупоренном стеклянном В разделе 3.2. представлены капилляре при температуре образца ~25°C.

результаты по измерению скоростей Добавки в инкубационную смесь: сукцинат, ротенон и ADP (1, 4), сукцинат и ротенон генерации супероксидных радикалов (2), без добавок (3). Концентрация белка: 0.изолированными митохондриями мг/мл (1-3); 5 мг/мл (4).

сердца. Было показано, что регистрация с помощью спектроскопии ЭПР кинетики супероксид-зависимого окисления TIRON в свободные радикалы (семихиноны) TIRON•– является удобным и достаточно чувствительным методом измерения скорости образования супероксида электронными переносчиками митохондрий в условиях контролируемой оксигенации образца. В отсутствии ингибиторов скорость сукцинат-зависимого образования супероксидных радикалов в комплексе III (bc1 сегменте) была мала (~0.01 нмоль O2•–/мин/мг белка при 25°C), однако, в присутствии антимицина A, блокирующего перенос электронов от цитохромов b на окисленный коэнзим Q, сильно возросла (до 0.81.2 нмоль O2•–/мин/мг белка). В то же время, генерация O2•– в комплексе III полностью подавлялась миксотиазолом и стигмателлином – ингибиторами Qцикла, блокирующими перенос электронов на Fe-S центр Риске. При использовании глутамата и малата (субстратов комплекса I) добавление антимицина A в среду инкубации также сопровождалось усиленной генерацией O2•– в комплексе III дыхательной цепи.

В то же время, добавление ротенона, блокирующего в комплексе I как обратный, так и прямой перенос электронов, не приводило при использовании глутамата и малата к Рис. 2. Спектры ЭПР спиновой возникновению сигнала ЭПР ловушки TIRON в суспензии семихинона TIRON.

митохондрий сердца крысы. Добавки в инкубационную смесь: сукцинат и Раздел 3.3. посвящен антимицин A. Газовая среда в резонаторе: воздух (1, 4, 5), азот (2, 3).

исследованию влияния гипоксии разной Спектры записаны в следующих длительности и последующей условиях: 8 мин в воздухе (1); 10 мин в воздухе, 10 с (2) и 4 мин (3) в азоте; реоксигенации на скорость образования мин в воздухе, 10 мин в азоте, 10 с (4) и 4 мин (4) в воздухе.

супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца. Представлены спектры ЭПР TIRON в суспензии митохондрий, генерирующих супероксид в присутствии субстратов для комплексов I или II (малат-глутамат или сукцинат) и антимицина A. Переход из аэробных условий в условия гипоксии (смена газовой среды с воздуха на азот) сопровождался падением интенсивности сигнала семихинонов TIRON, образовавшихся в результате окисления спиновой ловушки TIRON супероксидными радикалами. Реоксигенация, в свою очередь, приводит к быстрому возрастанию сигнала TIRON•–, причем скорость образования супероксидных радикалов окажется больше, чем до гипоксии (рис. 2).

На рис. 3 показана зависимость скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями от длительности гипоксии при использовании субстратов дыхания комплексов I и II. Длительность гипоксии была в обоих случаях 10 мин и мин. Скорость образования O2•– возрастала, по сравнению с контрольным уровнем, уже после 10-минутной гипоксии, однако, увеличение длительности гипоксии не приводило к существенным изменениям.

Интенсивность сигнала ЭПР от TIRON после 30 или 45 мин гипоксии была практически такой же, как и после 10-минутной Рис. 3. Зависимость скорости образования супероксида в суспензии митохондрий гипоксии.

сердца крысы от субстратов окисления и длительности гипоксии. Добавки в Таким образом, гипоксия и инкубационную смесь: сукцинат и последующая реоксигенация антимицин A (светлосерые столбики);

глутамат, малат, и антимицин A сопровождается определенными (темносерые столбики). Условия инкубации:

10 мин в воздухе (1); 10 мин в воздухе, изменениями в мембранах мин в азоте, 10 мин в воздухе (2); 10 мин в изолированных митохондрий воздухе, 30 мин в азоте, 10 мин в воздухе (3). Температура образца: ~25°C.

сердца, вызывающими увеличение скорости образования O2•– электронными переносчиками (семихинонами коэнзима Q) комплекса III дыхательной цепи. Однако, в отличие от митохондрий, выделенных из сердец после ишемии-реперфузии, величина эффекта не зависела от длительности гипоксии. Полученные данные позволяют заключить, что изолированные митохондрии сердца, находящиеся в среде инкубации, характеризуются большей невосприимчивостью к гипоксии, чем митохондрии в клетках сердечной мышцы, подвергнутой ишемии.

В разделе 3.4. приведены результаты исследования зависимости скорости генерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердца крысы от присутствия в среде инкубации адриамицина (доксорубицина) – эффективного противоопухолевого препарата, обладающего, однако, значительной кардиотоксичностью.

Добавление адриамицина в среду инкубации приводило к увеличению интенсивности сигнала ЭПР от TIRON, т.е. к заметному росту скорости образования супероксидных радикалов. Рост скорости образования O2•– наблюдался во всем исследованном нами интервале концентрации адриамицина (10-150 мкМ). В то же Рис. 4. Зависимость скорости образования время, генерация доступных супероксида в митохондриях сердца крысы от добавок в реакционную смесь.

спиновым ловушкам супероксидных Добавки в среду инкубации: сукцинат и радикалов вблизи границы антимицин A (1), сукцинат, антимицин A и адриамицин (2), сукцинат, антимицин A, внутренней мембраны с адриамицин и стигмателлин (3), сукцинат и адриамицин (4). Условия инкубации: межмембранным пространством в мин или 20 мин, температура ~25°C, митохондриях, модифицированных концентрация адриамицина 50 мкМ.

Кроме 3-4 (при 10-минутной инкубации), адриамицином, почти полностью различия между образцами статистически подавлялась стигмателлином – достоверны (P < 0.05).

ингибитором Q-цикла, блокирующим перенос электронов на Fe-S центр Риске. В отличие от стигмателлина, ротенон, блокирующий в комплексе I как обратный, так и прямой перенос электронов, не приводил в присутствии субстратов этого комплекса (глутамата и малата) и адриамицина к полному исчезновению сигнала ЭПР от TIRON.

Показаны зависимости скорости генерации супероксидных радикалов в изолированных митохондриях сердца от присутствия адриамицина и ингибиторов дыхательной цепи в среде инкубации при использовании сукцината (субстрата окисления для комплекса II) (рис. 4) или при использовании глутамата и малата (субстратов окисления для комплекса I). Длительность инкубации митохондрий в условиях непрерывной аэрации была в обоих случаях равна 10 мин и 20 мин. Скорость образования O2•– возрастала, по сравнению с исходным уровнем, уже после десятиминутной инкубации в присутствии адриамицина. Увеличение длительности инкубации до 20 мин вызывало некоторый рост скорости образования супероксида во всех образцах, однако, не приводило к изменению общих закономерностей действия адриамицина. В митохондриях, модифицированных адриамицином, скорость генерации супероксидных радикалов всегда была выше, чем в митохондриях, в среде инкубации которых отсутствовал адриамицин. Эффект адриамицина наблюдался также в опытах с митохондриями, выделенными либо после серии уколов адриамицина животным, либо после перфузии изолированного сердца в присутствии адриамицина в среде для перфузии.

В наших опытах in vitro на изолированных митохондриях сердца адриамицин находился в среде инкубации и, благодаря специфическому взаимодействию с кардиолипином, включался во внутренние мембраны этих органелл. Находясь в митохондриях, редокс-активный адриамицин способен либо непосредственно принимать электроны с переносчиков электронтранспортной цепи и передавать их молекулярному кислороду с образованием супероксидных радикалов, либо вызывать наблюдаемый в наших опытах значительный рост скорости образования O2•– за счет изменения физико химических характеристик липидного окружения компонентов дыхательной цепи.

В разделе 3.5. представлены данные изучения взаимодействия цистеиновых ДНКЖ с супероксидом, генерируемым митохондриями сердца крысы. Представлены кинетики деструкции цистеиновых ДНКЖ (в мономерной парамагнитной форме) в условиях образования супероксида комплексом III дыхательной цепи митохондрий (рис. 5). Деструкция ДНКЖ в присутствии митохондрий, субстрата комплекса II сукцината и ингибитора антимицина А происходит существенно быстрее, чем в контроле.

При добавление супероксиддисмутазы (СОД) скорость распада ДНКЖ практически совпадает со скоростью в контроле. Этот факт доказывает, что супероксидный радикал влияет на распад ДНКЖ. Следует отметить, что зависимая от супероксида деструкция ДНКЖ наблюдалась в присутствии избытка цистеина, также являющегося антиоксидантом.

Таким образом, ДНКЖ были более эффективным «скавенджером» супероксида, чем цистеин. Можно предположить, что ДНКЖ является достаточно эффективным протектором, защищающим клетку от спероксидных радикалов, источником которого являются митохондрии.

Также приведены данные Рис. 5. Деструкция цистеиновых ДНКЖ в условиях генерации супероксида. (1) экспериментов, где в присутствии митохондрии сердца крысы, цистеиновые ДНКЖ; (2) митохондрии сердца крысы, цистеина, донора нитроксильного цистеиновые ДНКЖ, сукцинат, антимицин A;

аниона соли Ангели и ферритина (3) митохондрии сердца крысы, цистеиновые ДНКЖ, сукцинат, антимицин A, СОД.

происходит образование ДНКЖ. В Инкубационная смесь в фосфатном буфере присутствие митохондрий и (рН=7,5), температура ~25°C.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»