WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

% от контроля % от контроля Митотический индекс, Cодержание цитокининов, Для поддержания повышенного уровня ЦК необходим именно ЭБ, поскольку удаление его из среды инкубации проростков приводит к снижению до уровня контроля содержания ЦК через 1 ч в корнях и 2-3 ч – в побегах (рис. 4).

корни побеги 250 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 0.4 нМ ЭБ 0.4 нМ ЭБ 200 5 15 30 60 120 5 15 30 60 120 Время, мин Время, мин Рис. 2. Динамика содержания цитокининов в корнях и побегах при коротких экспозициях проростков пшеницы на среде, содержащей 0.4 нМ и 0.4 мкМ 24-эпибрассинолид К 0.4 мкМ ЭБ 9 24 Время, ч Рис. 3. Динамика содержания цитокининов в корнях проростков пшеницы при длительной экспозиции их на растворе 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида Полученные данные свидетельствуют в пользу важной роли эндогенных цитокининов в проявлении физиологического действия 24-эпибрассинолида на растения пшеницы и вероятности участия ЭБ в регуляции метаболизма цитокининов.

% от контроля % от контроля Содержание цитокининов, Содержание цитокининов, нг/г сырой массы Содержание цитокининов, корни побеги 300 ЭБ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 0.4 нМ ЭБ 0.4 нМ ЭБ -ЭБ -ЭБ 1 2 3 1 3 1 2 3 1 3 Время, ч Время, ч Рис. 4. Влияние присутствия 24-эпибрассинолида и его удаления из среды инкубирования на содержание цитокининов в корнях и побегах 4-сут проростков пшеницы Участие 24-эпибрассинолида в регуляции деградации цитокининов в растениях пшеницы. Известно, что содержание активных форм ЦК в растениях эффективно регулируется цитокининоксидазой (ЦО), обеспечивающей их распад (Hare, van Staden, 1994; Novakova et al., 2005). В связи с этим можно было предположить, что ЭБ-индуцированное увеличение содержания эндогенных ЦК в проростках пшеницы обусловлено торможением их деградации под влиянием ЭБ. Нами были проведены опыты по оценке влияния ЭБ на интенсивность транскрипции гена цитокининоксидазы и ее ферментативную активность в корнях и побегах проростков пшеницы.

Оказалось, что ЭБ вызывал существенное торможение транскрипционной активности экспрессии гена ЦО сначала в корнях (через 30 мин), а затем в побегах (через 3 ч), причем максимальный уровень вызванного ЭБ снижения транскрипционной активности гена ЦО в целом сопоставим в корнях и побегах (рис. 5А).

В то же время детальный анализ содержания ЦК в корнях проростков выявил их значительное накопление уже через 5 мин от начала воздействия ЭБ (рис. 2). Столь быстрые изменения в содержании цитокининовых гормонов могут быть обусловлены изменениями в ферментативной активности ЦО под % от контроля % от контроля Содержание цитокининов, Содержание цитокининов, влиянием ЭБ. Действительно, в корнях обработанных ЭБ проростков некоторое уменьшение активности ЦО наблюдалось уже через 5 мин; через 20 мин оно достигало 30%-ного уменьшения от уровня контроля, которое сохранялось на этом уровне в течение всего опыта (рис. 5Б). ЭБ тормозил активность ЦО также в побегах, причем исходный уровень активности ЦО в побегах превышал таковую в корнях, а ингибирование под влиянием ЭБ активности фермента в побегах более сильно выражено (рис. 5Б).

А корни побеги 120 100 К 0.5 1 3 7 К 0.5 1 3 Время, ч Время, ч Б корни побеги 400 300 Контроль Контроль 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 5 20 40 5 20 40 Время, мин Время, мин Рис. 5. Влияние 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида на экспрессию гена (А) и ферментативную активность (Б) цитокининоксидазы в корнях и побегах 4-сут проростков пшеницы. К – контроль Удаление ЭБ из среды инкубирования вызывало постепенное возвращение транскрипционной активности гена цитокининоксидазы к контрольному значению, которое в корнях фиксировалось уже через 30 мин после прекращения действия гормона, а к трем часам - уровень экспрессии ЦО % от контроля % от контроля Экспрессия гена ЦО, Экспрессия гена ЦО, Активность ЦО, Активность ЦО, пмоль/мг белка*ч пмоль/мг белка*ч корней опытных проростков соответствовал контролю. В побегах заметное увеличение уровня транскриптов ЦО наблюдалось позднее – через 1 ч после прекращения обработки (рис. 6А). Что касается ферментативной активности ЦО, то в корнях активность ЦО возрастала до контрольного значения уже к мин прекращения действия гормона, а в побегах - к 60 мин (рис. 6Б).

А корни побеги 120 ЭБ -ЭБ ЭБ -ЭБ 100 80 60 40 20 0 К 3 0.5 1 К 3 0.5 1 Время, ч Время, ч Б корни побеги Контроль 400 800 Контроль 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 5 20 40 60 40 5 20 40 60 40 ЭБ -ЭБ ЭБ -ЭБ Время, мин Время, мин Рис. 6. Влияние присутствия 24-эпибрассинолида и его удаления из среды инкубирования на экспрессию гена (А) и ферментативную активность (Б) цитокининоксидазы в корнях и побегах 4-сут проростков пшеницы. К-контроль Таким образом, нами впервые продемонстрировано участие ЭБ в регуляции ферментативной активности и экспрессионного статуса гена ЦО в растениях пшеницы.

Влияние 24-эпибрассинолида на новообразование гормонов цитокининовой природы в растениях пшеницы. ЭБ-индуцированное увеличение содержание эндогенных ЦК в проростках пшеницы может быть % от контроля % от контроля Экспрессия гена ЦО, Экспрессия гена ЦО, Активность ЦО, Активность ЦО, пмоль/мг белка*ч пмоль/мг белка*ч обусловлено и влиянием ЭБ на новообразование цитокининов. В связи с этим мы исследовали влияние 0.4 мкМ ЭБ на суммарный уровень производных изопентиниладенина, иммунореактивных к сыворотке, полученной к изопентиниладенозину, и нуклеотида зеатина (НК), которые рассматривают в качестве первичных соединений на пути биосинтеза зеатина (Haberer, Kieber, 2002; Hirose et al., 2008). Обнаружено, что обработка проростков ЭБ вызывала существенное увеличение нуклеотида зеатина и суммарного уровня производных изопентиниладенина и в корнях, и в побегах 4-сут проростков пшеницы (рис. 7А), что свидетельствует в пользу активации под влиянием ЭБ синтеза ЦК.

А корни побеги 500 500 НК НК ИПА ИПА 400 300 200 100 0 0,5 1 3 0,5 1 Время, ч Время, ч Б корни побеги 800 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 400 0 10 20 40 10 20 Время, мин Время, мин Рис. 7. Влияние 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида на уровень нуклеотида зеатина и суммарное содержание производных изопентиниладенина (А) и накопление О-глюкозидов (Б) в корнях и побегах 4 сут проростков пшеницы Другим механизмом регуляции быстрого накопления ЦК может служить гидролиз O-глюкозидов - запасных форм активных ЦК. Однако, как видно из % от контроля % от контроля Содержание форм ЦК, Содержание форм ЦК, Содержание Содержание % от контроля о-глюкозидов, % от контроля о-глюкозидов, рис. 7Б, в ответ на обработку ЭБ и в корнях, и побегах наблюдалось быстрое и довольно сильное повышение уровня O-глюкозидов. По-видимому, этот результат связан с тем, что опыты проводились на молодых активно метаболизирующих интенсивно растущих проростках, не имеющих больших резервов цитокининов, и накопление O-глюкозидов может служить дополнительным доводом в пользу активации под влиянием ЭБ биосинтеза ЦК, значительно превышающих запросы на них побегов, избыток которых выводится в запасной пул.

Влияние предобработки 24-эпибрассинолидом на рост и гормональный статус проростков пшеницы при засолении. При сравнении функций брассиностероидов и цитокининов обращает на себя внимание тот факт, что обе эти группы фитогормонов обладают ярко выраженным ростстимулирующим и антистрессовым действием (Liu, Huang, 2002;

Чернядьев, 2005; Arteca, Arteca, 2008; Vert et al. 2008; Bajguz, Hayat, 2009). В связи с этим, можно предположить, что не только ростстимулирующий, но и антистрессовый эффект ЭБ может быть опосредован регуляцией под его влиянием стойкого увеличения вдвое уровня цитокининов. Поэтому мы провели анализ влияния ЭБ на рост растений пшеницы в норме и при воздействии засоления с оценкой вклада эндогенных цитокининов в этот процесс.

Из рис. 8 видно, что предобработка 3-сут проростков пшеницы 0.4 мкМ ЭБ в течение 24 ч хотя и не предотвращала повреждающего действия засоления на рост растений пшеницы, но значительно снижала его степень. Кроме того, оценка интенсивности деления клеток корней проростков пшеницы, предобработанных и необработанных ЭБ и подвергнутых кратковременному воздействию засоления, выявила защитный эффект фитогормона на этот показатель, который проявился в поддержании повышенного уровня МИ клеток меристемы кончиков корней предобработанных ЭБ проростков в сравнении с необработанными (рис. 9).

12 К NaCl ЭБ+NaCl К NaCl ЭБ + NaCl Рис. 9. Митотическая активность клеток меристемы кончиков корней обработанных и необработанных 24-эпибрассинолидом 4-сут проростков пшеницы в условиях засоления. 3-сут проростки К NaCl ЭБ+NaCl предобрабатывали в течение 24 ч 0.4 мкМ ЭБ и затем подвергали действию 2%-ного NaCl в течение 3 ч. Контрольные проростки (К) 7,обрабатывали дистиллированной водой 6,6 Известно, что рост растений К NaCl ЭБ+NaCl находится под контролем эндогенной гормональной системы Рис. 8. Влияние предобработки 24-эпибрассинолидом на ростовые и одновременный анализ разных параметры проростков пшеницы в групп фитогормонов в одних и тех условиях засоления. 3-сут проростки инкубировали в течение 24 ч на среде, же растениях позволяет получить содержащей 0.4 мкМ ЭБ, и затем комплексную картину изменений в подвергали воздействию 2%-ного NaCl в течение 7 ч. Контрольные растения (К) состоянии гормональной системы. В обрабатывали дистиллированной водой связи с этим нами был проведен анализ количественного уровня АБК, ИУК и ЦК в предобработанных и необработанных ЭБ растениях, подвергнутых воздействию 2%-ного хлорида натрия.

Длина 1 проростка, см Митотический индекс, % Сырая масса 1 проростка, мг Сухая масса 1 проростка, мг Как видно из рис. 10, засоление вызывает в растениях перестройки в гормональной системе, связанные с накоплением АБК и существенным снижением уровня ауксина и ЦК. Предобработка ЭБ способствовала снижению степени повреждающего действия К NaCl ЭБ ЭБ+NaCl солевого стресса на баланс АБК и ИУК, в то время как содержание ЦК в предобработанных ЭБ и подвергнутых стрессу растениях 0 поддерживалось на уровне 2 4 предобработанных гормоном растениях в норме.

Следовательно, способность ЭБ регулировать метаболизм ЦК, вероятно, лежит в основе предотвращения снижения в обработанных ЭБ растениях 2 4 концентрации цитокининовых 150 гормонов при засолении, что, в конечном счете, может способствовать повышению устойчивости предобработанных ЭБ растений пшеницы к натрий2 4 хлоридному засолению.

Время, ч Таким образом, полученные Рис. 10. Динамика содержания АБК, результаты свидетельствуют в ИУК и цитокининов в пользу важной роли эндогенных ЦК предобработанных и необработанных 24-эпибрассинолидом 4-сут проростках в проявлении ростстимулирующего пшеницы в условиях засоления.

действия ЭБ в норме, а также, 3-сут проростки предобрабатывали в течение 24 ч 0.4 мкМ ЭБ и затем вероятно, и в поддержании ростовых переносили на среду с 2%-ным NaCl.

процессов растений при стрессе на Контрольные растения обрабатывали дистиллированной водой уровне близком контролю.

нг/г сырой массы Содержание АБК, нг/г сырой массы Содержание ИУК, Содержание ЦК, нг/г сырой массы Сравнительный анализ влияния 24-эпибрассинолида и 6-бензиламинопурина на уровень осмопротектантов в растениях пшеницы.

С целью выявления возможного вклада эндогенных ЦК в реализацию предадаптирующего действия ЭБ на растения к последующему воздействию стресса нами были проведены опыты по сравнительному анализу влияния ЭБ и БАП на уровень экспрессии TADHN гена дегидрина и концентрацию пролина как ключевых осмопротектантов, играющих важную роль в формировании устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, вызывающим обезвоживание (Beck et al., 2007; Silva-Ortega et al., 2008).

3.7 мкМ АБК 0.4 мкМ ЭБ Время, ч Рис. 11. Уровень экспрессии гена TADHN дегидрина в корнях 4-сут обработанных 3.7 мкМ АБК и 0.4 мкМ 24-эпибрассинолидом проростков пшеницы Из данных, приведенных на рис. 11 и 12, видно, что ЭБ и БАП повышали уровень экспрессии TADHN гена дегидрина пшеницы, хотя динамика этого процесса в ответ на обработку гормонами заметно различалась. Так, ЭБ вызывал относительно быстрое усиление экспрессии TADHN гена, сопоставимое по времени с действием экзогенной АБК, являющейся признанным индуктором транскрипции генов дегидринов (Аллагулова и др., 2003), с максимумом на 6 ч, правда, уступая ей по уровню действия. В то время как активация транскрипционной активности TADHN гена дегидрина под влиянием БАП происходила лишь спустя 6 ч от начала воздействия (рис. 12).

гена TADHN, % от контроля Уровень экспрессии Это позволило предположить, что наблюдаемый эффект БАП опосредован увеличением под его влиянием содержания АБК, поскольку в литературе имеются сведения о способности не только экзогенных, но и эндогенных цитокининов вызывать накопление АБК (Авальбаев и др., 2001;

Arkhipova et al., 2007).

220 TADHN АБК 180 140 100 0 0.5 1.5 3 5 6 9 60 Время, ч Рис. 12. Динамика содержания АБК и уровня экспрессии гена TADHN дегидрина в корнях 4-сут проростков пшеницы в ходе обработки 4.4 мкМ 6-бензиламинопурином Действительно, БАП индуцировал обратимое накопление АБК в проростках, предшествующее усилению транскрипции гена дегидрина, что говорит в пользу вероятности регуляции БАП экспрессии гена дегидрина опосредовано через накопление АБК.

Таким образом, полученные данные показывают, что ЭБ способен активировать экспрессию TADHN гена дегидрина независимо от АБК, поскольку обработка проростков ЭБ в используемой концентрации не вызывает изменений в содержании эндогенной АБК (Шакирова и др., 2002; Авальбаев и др., 2003), тогда как регуляция транскрипции исследуемого гена под влиянием цитокинина, вероятно, является АБК-зависимой.

С целью выяснения вовлечения эндогенной АБК в формирование индуцируемых ЭБ и БАП защитных реакций в растениях мы провели опыты с использованием эффективного ингибитора биосинтеза АБК флуридона.

гена TADHN, % от контроля % от контроля Содержание АБК, Уровень экспрессии Из рис. 13А видно, что флуридон, подавляя новообразование АБК, не оказал никакого эффекта на вызываемое ЭБ накопление пролина в проростках, в то же время полностью предотвратил действие БАП на этот показатель (рис.

13Б).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»