WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

На основании данных о размерах геномов [www.genomesize.com], о числе повторов рДНК в контрольном геноме и полученных значений C(T), можно приблизительно рассчитать количество повторов рДНК в геномах исследуемых рептилий. Например, С(Т) L.cau отстает от С(Т) H. sap на полтора цикла, следовательно количество субстрата, участвующее в ПЦР, у L. cau в 21,5, т.е. в 3 раза больше, чем у человека. При этом размер генома L. cau ~ в 1,6 раза меньше размера генома человека. Следовательно, количество повторов рДНК в геноме L. cau приблизительно в 5 раз меньше, чем в геноме человека (Табл. 2).

Таблица 2. Оценка количества мономеров рДНК в геномах ящериц методом ПЦР в реальном времени.

Объект C(Т) Размер генома (п.н.) Кол-во рДНК повторов на гаплоидный геном H.sap ~18,5 3 х109 200-L.val ~19 ~2 х109* 80-L.agi ~19 1,6-2,1 х109 80-E.mur ~18 ~2 х109* 120-L.cau ~20 1,9 х109 40-I.igu ~20 ~2 х109* 40-V.exa ~17 1,7-2,4 х109 200-*среднее по семейству [www.genomesize.com] Таким образом, полученные нами данные указывают на необычно малый для позвоночных размер повторяющейся единицы рДНК (~10– 15 т.п.н.) у исследованных видов ящериц, при этом количество копий рДНК в их геномах достаточно сильно варьирует: от ~10 у U. stansburiana до 300 у V. exant. в расчете на гаплоидный геном, оставаясь, тем не менее, близким в пределах отдельных подсемейств.

2. Структурная организация и изменчивость ВТС2 чешуйчатых рептилий 2.1 Сравнительный анализ первичной структуры Нами проведено клонирование, секвенирование и сравнительное исследование рибосомного внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ВТС2) у 15 видов ящериц, принадлежащих к трем инфраотрядам: Scincomorpha, Varanоidea и Iguania. Анализ последовательности ВТС2 показал, размер исследуемых последовательностей варьирует от 301 у Iguana iguana до 713 у Lacerta strigata (таб. 3).

Анализ первичной структуры ВТС2 показал, что во всех нуклеотидных последовательностях ВТС2 ящериц различные основания представлены неравномерно, содержание GC составляет 78-80%, что характерно для других позвоночных, и содержат пять консервативных участков, аналогичных тем, которые были выявлены при построении обобщенной консенсусной вторичной структуры ВТС-2 позвоночных [Joseph et al., 1999]. В ходе сравнительного анализа было обнаружено, что у ящериц с «длинными» ВТС2 консервативные элементы расположенные в 3’- половине проявляют некоторое сходство с нуклеотидными блоками 5’- половины. Мы провели выравнивание «коротких» ВТС2 двух ящериц инфраотряда Iguania L. caucasia, I. iguania и амфибии X.

laevis c 5’- и 3’- половинами «длинных» ВТС2 ряда других ящериц. Был выявлен ряд регулярно чередующихся нуклеотидных блоков (столбцов) с высокой (65-80%) степенью сходства (рис.6).

Таблица 3. Размеры ВТС2 чешуйчатых рептилий.

сокращенное семейство Acc. N вид п.н.

обозначение Darevskia armeniaca D.arm AY Darevskia nairensis D.nai DQDarevskia valentini D.val DQDarevskia rostombekovi D.ros DQDarevskia portschinskii D.por DQLacertidae Darevskia mixta D.mix DQLacerta media L.med DQLacerta agilis L.agi DQLacerta strigata L.str AYGallotia sp. G.sp DQScincidae Eulamprus murrayi E.mur 469 DQ V.exa DQVaranus exant Varanidae I.igu DQ Iguana iguana Iguanidae U.sta 357 DQUta stansburiana L.cau AYAgamidae Laudakia caucasia отряд подотряд инфраотряд Scincomorpha Sauria Squamata Varan о idea Iguania Рис.6. Сравнительный анализ «коротких» ITS2 X. laevis и представителей инфраотряда Iguania с 5’- и 3’- частями «длинных» ITS2 других ящериц.

2.2 Сравнительный анализ предполагаемых вторичных структур ВТС2 всех позвоночных складывается из 3-5 высоко термодинамически устойчивых шпилек, разделенных относительно короткими однонитевыми участками.

Длина шпилек может заметно различаться у разных организмов, причем наиболее консервативные последовательности локализуются между шпильками и вблизи их основания [Joseph et al., 1999; Michot et al., 1999]. Основываясь на данной схеме, мы провели коррекцию выравнивания ВТС2, полученного с помощью пакета программ GeneBee Service и Multalin, в результате чего удалось совместить консенсусные последовательности. В результате было показано, что несмотря на достаточно большие различия в длине ВТС2, расположение шпилек и консенсусных последовательностей у всех исследуемых ящериц соответствует схеме предложенной Джозефом [Joseph et al., 1999] (рис. 7).

Рис. 7. Схема потенциальной вторичной структуры ITS2 позвоночных [Joseph et al., 1999;]. А, В, С, D – двуспиральные домены;

DI – DIV – вариабельные участки двуспиральных доменов; a, b1, b2, c, d – консервативные участки.

Изучение вторичной структуры ВТС-2, показало, что размер первой шпильки (D.I) незначительно варьирует у представителей амфибий, рептилий и млекопитающих: от п.н. у X. laevis до 45 п.н. у R. nor, за одним исключением – семейство Lacertidae, где шпилька D.I имеет размер почти втрое больше (82-107 п.н.).

Размер шпильки D.II более вариабелен: от 30 п.н. у X. laevis до 126 п.н. у G. Gallus.

Самый большой размер шпильки D.II среди исследованных ящериц имеют так же представители семейства Lacertidae (109-115 п.н.). Интересно отметить, что у последних в консенсусном участке, входящем в правую половину шпильки D.II, пара gt, консервативная у всех других сравниваемых организмов, замещена на ga (рис. 8). Эта специфичная для лацертид замена является компенсаторной и усиливает потенциальную способность к образованию вторичной структуры в основании D.II. Значительные размеры D.II у представителей семейства Lacertidae обусловлены дополнительными вставками на 5`-конце. Большинство этих вставок обладают внутренней комплементарностью и могут быть сложены в стабильные шпильки D.II`, которые являются характерной особенностью этого семейства (рис. 9).

Нуклеотидная последовательность между шпильками D.II и D.III является одной из наиболее важных консенсусных областей в ВТС2 позвоночных. Она образована 20-п.н., и в ней локализуется сайт процессинга для 8S предшественника 5.8S рРНК. Шпилька D.III отсутствует у представителей инфраотряда Iguania, как и у всех известных на сегодняшний день представителей птиц и амфибий. Небольшая (60-76 п.н.) шпилька D.III обнаружена у всех остальных исследованных ящериц. У млекопитающих, напротив, она весьма велика, например, у мыши в D.III содержится 418 п.н (рис.10).

Шпильки D.IV самые протяженные и наиболее вариабельные у всех позвоночных, а для образуемых ими потенциальных вторичных структур характерна высокая степень ветвления. В этой области ВТС-2 можно выделить консервативные элементы. У мыши внутри последовательности (5’-CGTCCG^TGCGCCGA-3’) в шпильке D.IV находится сайт процессинга, который обеспечивает образование предшественника 12S для 5.8S рРНК [Michot et al., 1999]. Аналогичный участок с помощью компьютерного моделирования был определен для рыб, амфибий, птиц и млекопитающих. У всех исследованных организмов этот сайт находится в центральной части D.IV [Joseph et al., 1999]. В ходе сравнительного анализа шпильки D.IV у всех ящериц был обнаружен аналогичный консервативный участок d (рис. 12).

Рис.8. Сравнительный анализ ВТС2 позвоночных. Цифрами указано число нуклеотидов вариабельных участков DI – DIV. Зеленым цветом выделены нуклеотиды формирующие характерную левостороннюю шпильку DII’. a, b1, b2, c, d – консервативные участки. Синим цветом выделены первые нуклеотиды в основаниях шпилек DI и DII.

Рис. 9. Потенциальная вторичная структура А и В доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. В прямоугольнике выделена шпилька DII’ характерная для истинных ящериц.

Рис.10. Потенциальная вторичная структура C доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. 1 – E. murayi, 2 – V. exant, 3 – G. gallotia, – D. portschinskii, 5 – D. armeniaca, 6 – D. mixta, 7 – D. nairensis, 8 – D. rostombekovi, 9 – D. valentine, 10 – L. agilis, 11 – L. strigata, 12 – L.

media, 13 – R. norvegicus, 14 – M. musculus, 15 – H. sapiens.

Рис. 11. Потенциальная вторичная структура D доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. 1– E. murayi, 2 – V. exant, 3 – G. gallotia, – D. portschinskii, 5 – D. armeniaca, 6 – D. mixta, 7 – D. nairensis, 8 – D. rostombekovi, 9 – D. valentine, 10 – L. сaucasia, 11- I. Iguana, 12 – U.

stansburiana, 13 - L. agilis, 14 – L. strigata, 15 – L. media, 16 – R. norvegicus, 17 – M. musculus, 18 – H. sapiens.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Ранее было показано, что нуклеотидные последовательности ВТС2 всех изученных эукариот содержат пять консервативных (консенсусных) элементов и обладают потенциальной способностью свертываться в три-пять шпилек различной длины (D.I – D.V), исходящих из центральной петли [Joseph et al., 1999; Coleman, 2005]. Нами детально охарактеризованы аналогичные шпильки для ВТС2 рептилий. Проведенное сравнение новых последовательностей с ортологичными участками амфибий и млекопитающих показало, что размеры отдельных шпилек D.I - D.V и всего ВТС2 в целом, значительно варьируют между разными таксонами.

Из всех организмов, участвующих в сравнении, самыми короткими вариабельными доменами D.I и D.II в ВТС2 ядерной рДНК обладают амфибия X. laevis, ящерицы инфраотряда Iguania и млекопитающие (Рис. 9). Домен D.II у всех чешуйчатых рептилий имеет близкие размеры. Наиболее короткие и наиболее длинные домены D.II обнаруживаются у амфибий, демонстрируя удивительно высокий разброс по длине (от п.н. у X. laevis до 108 п.н. у Rana nigramaticulata). Этот результат, по-видимому, отражает чрезвычайно высокую степень дивергенции ВТС2 в геномах амфибий. Очень короток домен D.II в ВТС2 млекопитающих, крысы, мыши и человека (15-29 п.н.). У истинных ящериц (Lacertidae) D.II содержит заметные левосторонние шпильки (D.II’), позиции которых совпадают с позицией короткой не спаренной области (4-8 н.) в D.II других позвоночных (Рис.8 и Рис.9) [Joseph et al., 1999; Воронов и др., 2006]. В ходе сравнительного анализа первичных структур у ящериц с «длинными» ВТС2 в 3’половине спейсера был обнаружен ряд консервативных сегментов, проявляющих высокую степень сходства с консенсусами Джозефа, и перемежающимися с менее гомологичными областями (Риc. 6).

Возникает вопрос, какие механизмы лежат в основе увеличения размера ВТС2. В настоящее время полагают, что гомогенизация в мультигенных семействах происходит в процессах репликации и репарации ДНК. Недавние генетические исследования показали, что в согласованной эволюции может играть существенную роль генная конверсия [Liao, 2000; Hashimoto et al., 2003]. В то же время, приблизительно двукратное эволюционное увеличение ВТС2 у истинных ящериц по сравнению с Iguania, а также обнаружение в его 3’-половине цепи сегментов ДНК, гомологичных консенсусным, указывает на возможность дупликации 5’-половины ВТС2, скорее всего за счет рекомбинации. В то же время, большой вклад в дивергенцию ортологичных участков ВТС2 позвоночных вносят инсерции/делеции коротких нуклеотидных последовательностей. Известно, что сам ВТСвпервые появился как интрон, некогда внедрившийся в 28S рДНК прокариотической клетки и отделивший 5.8S рДНК, прежде являвшуюся началом гена, от остальной его части [Jacq, 1981; Nazar, 1980]. Поэтому нельзя исключить возможность повторного внедрения в него по механизму ретропозиции и более протяженных элементов ВТС2.

На рисунке 12 приводится сравнение расширенных вариантов консенсусных последовательностей ВТС2 (а, с и d) у представителей различных классов позвоночных. Известно, что участки ВТС2, представленные в боксах а, с и d участвуют (в составе пре-рРНК) в связывании с РНК-шейперонами и/или нуклеазами процессинга.

Сравнение характера замещений нуклеотидов в пределах консенсусов и сравнение типов замещений у представителей различных таксонов позволяет выявить интересные закономерности.

Например, в положении 3 бокса a обнаруживается два варианта оснований: «C» или «A». Наличие основания «C» в этом положении объединяет такие далекие (если судить по их современным представителям) таксоны, как амфибии, млекопитающие и представителей инфраотряда Iguania. В то же время, у всех исследованных представителей инфраотряда Scincomorpha и у Varanus exant в данной позиции присутствует «A». В качестве другого примера можно привести наличие основания «A» в позиции 5 a-бокса, которое неожиданно оказывается общим для млекопитающих, птиц и аллигатора, тогда как у всех включенных в сравнение ящериц, относящихся к инфраотрядам Iguania, Scincomorpha и Varanoidea, данную позицию занимает «G».

Приведенные различия, возможно, маркируют этапы расхождения древних организмов на группы, каждая из которых впоследствии дала начало большому числу современных таксонов.

а с d X.lae gacg*tccatcg ccc*aaggcc*agaccc c*cggcggctgtctgtg H.sap gccgatcaatcg ccctaagcgc*agaccc ggccgcggc*g*ccggg M.mus gacgatcaatcg cccgaagttc*agacgt cgccgcggc*gtccgtg R.nor gacgatcaatcg cc*gaagttc*agacgt cgccgcggc*gtccgtg G.gal gcc*atcaatcg ccctaagtgc*agatcc ggc*gcggctgccggtg A.mis gacgatcaatcg ccctaagtgc*agacac cgc*gcggctgtctgtg I.igu gacggtcaatcg cc*gaagcgc*agatcc cgc*gcggctgtctgtg U.sta gacggtcaatcg ccc*aagcgc*agaccc cgc*gcggctgtctgtg L.cau gacggtcaatcg cccgaagtcc*agaccc cgc*gcggctgtctgtg C.cha gacggtcaatcg ccc*aagtcg*agaccc cgc*gcggctgtctgtg E.mur gaaggtcaatcg ccc*aaggcc*agacсc cgc*gcggctgtctgtg V.exa gaaggtcaatcg ccc*aaggcgcagaccc cgc*gcggctgtctgtg G.sp gaaggtcaatcg ccc*aagtcc*agaccc cgc*gcggctgtctgtg D.mix gaaggtcaatcg ccc*aagtcc*agaccc cgc*gcggctgtctgtg D.arm gaaggtcaatcg ccc*aagtcc*agaccc cgc*gcggctgtctgtg L.agi gaaggtcaatcg ccc*aagtcc*agaccc cgc*gcggctgtctgtg Рис. 12. Сравнение нуклеотидных последовательностей консервативных (консесусных) областей ВТС2 ответственных за: связывание с U3РНК (a), процессинг 8S предшественника 5.8S рРНК (c), процессинг предшественника 28S рРНК у представителей различных классов позвоночных (d).

Результаты сравнительного анализа консенсусных последовательностей (Рис. 12) позволяют предположить, что эволюция по отдельным консенсусам происходила с различной скоростью для разных таксонов. Например, у грызунов (мыши и крысы) в боксе c нуклеотиды в позициях 4, 9, 16 и 17 выбиваются из ряда всех сравниваемых в этом столбце последовательностей, тогда как в боксах a и d специфические для грызунов вариации отсутствуют.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»