WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Daco Galaxy (Дания) со скоростью 200 клеток/сек. Компьютерную обработку проводили с использованием программы FlowMax. В каждом образце анализировали 30 клеток.

Для изучения сравнительной динамики апоптотической гибели контрольных (необлученных) и облученных в дозе 1 Гр лимфоцитов при инкубации в полной среде in vitro использовали метод проточной цитофлуорометрии с анализом фосфатидилсерин-позитивных клеток и клеток с поврежденной мембраной. Известно, что после индукции апоптоза происходит переход молекул фофатидилсерина с внутренней стороны клеточный мембраны на наружную. Данное событие является необратимым и свидетельствует о том, что в клетках запущен механизм апоптотической гибели.

Идентификация фосфатидилсерин-позитивных клеток основана на специфическом связывании фофатидилсерина аннексином 5 (плацентарный антикоагулирующий белок-1) конъюгированным с флуоресцентным красителем (FITC). Анализ фосфатидилсерин-позитивных клеток методом проточной цитофлуорометрии является одним из наиболее быстрых и эффективных методов обнаружения апоптотических клеток. Использование комбинированного окрашивания клеток флуоресцентными красителями, конъюгированными с аннексином 5, и йодистым пропидием, проникающим только в погибшие клетки с нарушенной мембраной, позволяет раздельно детектировать раннюю и позднюю стадии апоптоза, а также некроз.

Окраску лимфоцитов проводили с использованием набора «Аннексин V» (Beckman Coulter), согласно прилагающемуся протоколу. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Daco Galaxy (Дания) со скоростью 200 клеток/сек. Компьютерную обработку проводили с использованием программы FlowMax. Анализ клеток в образце проводили по четырем параметрам: интенсивность прямого и бокового светорассеяния (FSC/SSC) в линейных координатах и интенсивность флуоресценции FITC и пропидий йодида (FL1/FL2) в логарифмических единицах. В каждом образце анализировали 30 000 клеток.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием программы Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Уровень разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных Уровень повреждений ДНК, определяемый с помощью метода ДНК-комет, в клетках человека может сильно варьировать в зависимости от наличия заболеваний (Collins et al., 1998) и курения (Frenzilli et al., 1997).

Поэтому для исследований отбирались только здоровые, некурящие доноры в возрасте от 30 до 50 лет. Результаты исследований 33 контрольных доноров показали, что в контрольной когорте наблюдаются существенные индивидуальные различия в исходных уровнях разрывов ДНК, но не один из доноров не выходил за границы 95%-ного доверительного интервала (табл. 1). Полученные результаты, в целом, свидетельствуют об адекватном выборе контрольной когорты.

Исследования лимфоцитов крови летчиков показали, что в когорте летчиков параметры распределения уровня разрывов ДНК резко отличаются от контрольных (табл. 1). Средние значения уровней разрывов ДНК 6-ти летчиков выходят за верхнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения, в то время как для 1 летчика этот показатель выходит за нижнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения. Сравнение дисперсий распределения уровней разрывов ДНК в группах летчиков и контроле, показало, что эти различия статистически достоверно различаются по F критерию Фишера. Таким образом, условия полетов приводят к возрастанию индивидуальной вариабельности и по уровню разрывов ДНК лимфоцитов крови.

В отличие от результатов, полученных при обследовании летчиков, обследование небольшой когорты космонавтов не выявило статистически достоверных изменений уровня разрывов ДНК по сравнению с контролем (табл. 1). По всей видимости, отсутствие различий обусловлено более тщательным медицинским отбором и последующим контролем за состоянием здоровья. Кроме того исследования космонавтов проводились спустя 10-лет после прекращения полетов.

Наиболее выраженные изменения уровня разрывов ДНК были зарегистрированы при исследовании онкологических больных с раком простаты. Было показано, что у онкобольных до лечения среднее значение момента хвоста ДНК-комет было статистически достоверно выше контрольного значения в 2.3 раза (табл. 1). Во время лечения онкобольных среднее значение момента хвоста ДНК-комет лимфоцитов увеличивалось еще в большей степени (~3.4 раза по сравнению с контролем) и статически достоверно отличалось от контроля (t=2.55, p<0.05), что, по всей видимости, является следствием лучевой терапии опухоли. Дисперсии распределения уровней разрывов ДНК в группах онкобольных и контроле статистически достоверно различаются по F критерию Фишера.

Таблица 1. Параметры распределения уровней разрывов ДНК (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных.

Группа N Среднее ± SD N ex t F SE 95% Контроль 33 8,87± 0.60 3.46 0 - Летчики 41 9.46± 1.03 6.59 7 0.64 3. p<0.Космонавты 8 8.55±1.90 5.38 1 0.84 2.Онкобольные до 18 20.15± 1.91 8.09 13 6.98 5.лечения p<0.001 p<0.Онкобольные во 6 29.76±3.14 7.68 6 11.00 4.время лечения p<0.001 p<0.Примечание. N – число обследованных людей; SE -стандартная ошибка; SD стандартная дисперсия; N ex 95% - число людей, выходящих за границу соответствующего 95% доверительного интервала контрольной группы; t -значения tкритерия Стьюдента при сравнении с контрольным распределением; F - значения F критерия Фишера при сравнении с дисперсией контрольного распределения.

2. Повреждаемость ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных при дополнительном облучении in vitro В настоящей главе представлены результаты исследования индукции двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных при дополнительном воздействии -излучения в дозе 1 Гр. Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК использовали метод ДНК-комет. Предполагается, что именно двунитевые разрывы ДНК влияют на фрагментированность ДНК, определяемую методом ДНК-комет при проведении электрофореза в нейтральных условиях (Calini et al., 2002). Выход радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК для редкоионизирующего излучения может колебаться от 20 до 50 на клетку/Гр (Ward, 1988) и зависит от состояния антиоксидантных защитных систем клеток и степени конденсации хроматина (в активных областях, где доступ свободных радикалов к ДНК не лимитирован белками количество радиационных повреждений ДНК значительно выше, чем в неактивных областях). В наших предварительных исследованиях было показано, что значения момента хвоста ДНК-комет статистически достоверно (r>0.9, р<0.01) коррелирует с количеством фосфолирированного гистона Н2AX (-Н2AX), то есть с количеством распознанных двунитевых разрывов ДНК.

Облучение лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков и онкологических больных in vitro в дозе 1 Гр приводило к статистически достоверному увеличению уровня разрывов ДНК, регистрируемому методом ДНК-комет почти во всех обследованных группах за исключением группы космонавтов (рис. 2).

Дополнительно проводили исследования изменений уровня гистона -Н2AX в лимфоцитах отдельных индивидуумов из групп контрольных доноров, а также онкологических больных до и время лечения. Было показано:

1. В лимфоцитах крови онкологических больных до лечения уровень гистона -Н2AX выше чем лимфоцитах контрольных доноров;

2. Лучевая терапия рака простаты приводит к увеличению уровня -Н2AX в лимфоцитах крови по сравнению с показателями до лечения;

3. Дополнительное облучение лимфоцитов крови в дозе 1 Гр вызывает увеличение уровня -Н2AX во всех исследованных группах.

В целом, результаты исследований подтверждают данные полученные помощью метода ДНК-комет.

Рис. 2. Уровни разрывов ДНК лимфоцитов крови в различных исследуемых когортах до и после облучения клеток in vitro в дозе 1 Гр. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. *** - p<0.001, * - p < 0.05 – достоверность различий по сравнению с исходным уровнем.

Так как межгрупповые уровни исходных разрывов ДНК значительно различались, то для оценки радиоповреждаемости ДНК нами было сочтено целесообразным использование значений увеличения момента хвоста ДНК-комет после дополнительного облучения в дозе 1 Гр за вычетом значений до облучения (инкремент момента хвоста). Инкремент момента хвоста был рассчитан для каждого человека. Результаты статистического анализа полученных данных представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2 вариабельность уровня двунитевых разрывов ДНК вызванных облучением была высока, но не одно из значений не выходило за границы 95%-ного доверительного интервала. В группе летчиков отмечалось статически достоверное (p<0.05) увеличение повреждаемости ДНК при облучении по сравнению с контролем. Дисперсии распределения уровня двунитевых разрывов ДНК в группе летчиков и контроле после облучения в дозе 1 Гр также статистически достоверно различались по F критерию Фишера (p<0.05). Уровни радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов крови 9-ти летчиков выходили за верхнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения. Увеличение радиоповреждаемости ДНК свидетельствует, о том, что у отдельных индивидуумов полеты ведут к изменениям молекулярно-клеточных параметров, определяющих уровень первичных радиационноиндуцируемых повреждений ДНК (степень конформации хроматина, уровню экспрессии генов и концентрации эндогенных антиоксидантов, находящихся в непосредственной близости от ДНК).

Анализ данных, полученных при исследовании лимфоцитов крови космонавтов, показал отсутствие достоверных различий среднего значения уровня радиационно-индуцированных разрывов ДНК (табл. 2).

Таблица 2. Значения абсолютного увеличения (инкремент) момента хвоста ДНК-комет (усл. ед.) лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных после облучения клеток in vitro в Гр за вычетом значений до облучения.

Группа N Среднее ± SD N ex t F SE 95% Контроль 33 10.93 ±1.14 6,54 0 - - Летчики 41 15.93±1.53 9,78 9 2.52 2. p<0.05 p<0.Космонавты 8 9.00±3.54 10,01 1 0.67 2.Онкобольные до 18 19.11±2.55 10,82 7 3.37 2.лечения p<0.01 p<0.Онкобольные во 6 12.99±2.56 6,28 1 0.71 1.время лечения Примечание. N – число обследованных людей; SE -стандартная ошибка; SD стандартная дисперсия; N ex 95% - число людей, выходящих за границу соответствующего 95% доверительного интервала контрольной группы; t -значения tкритерия Стьюдента при сравнении с контрольным распределением; F - значения F критерия Фишера при сравнении с дисперсией контрольного распределения.

Наиболее выраженное увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении отмечалось для онкологических больных до лечения.

Среднее значение инкремента момента хвоста ДНК-комет, у онкологических больных было почти в два раза статистически достоверно (p<0.001) выше по сравнению с контролем (табл. 2). Помимо увеличения среднего значения инкремента момента хвоста, в группе онкологических больных отмечалось статистически достоверное (p<0.05) увеличение дисперсии распределения уровня разрывов ДНК по сравнению с контрольным распределением (табл. 2). Уровни радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов крови 7-ти онкольных выходили за верхнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения.

Анализ данных полученных при исследовании онкологических больных после лечения не выявил изменений повреждаемости ДНК при дополнительном облучении (табл. 2). Возможно, вследствие значительно меньшей статистической выборки.

Для целей практической медицины чрезвычайно важно помимо общих оценок исследуемых групп дать оценку радиочувствительности каждого конкретного индивидуума. На рис. 3 представлено распределение контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных по исходным уровням разрывов ДНК лимфоцитов и уровням разрывов ДНК после облучения клеток in vitro. Пунктирными линиями показаны границы 95 % доверительного интервала для контрольной группы. Такая форма представления данных позволяет нам разделить всех исследуемых индивидуумов на 4-е группы. К первой группе относятся люди с условно нормальным уровнем разрывов ДНК и условно нормальной радиоповреждаемостью ДНК. Видно, что из 33 контрольных доноров к этой группе относятся 32 человека (~ 97 %), в то время как из 41 обследованного летчика к первой группе можно отнести только 26 человек (~ 63 %). В случае космонавтов это 7 чел. (~ 88 %). Для группы онкологических больных до лечения только 3 человека из 18 обследованных (~ 17 %). Для онкологических больных после лечения – 0. Вторая группа - это люди с «нормальным» исходным уровнем разрывов ДНК, но повышенной радиоповреждаемостью ДНК. К этой группе относятся 9 летчиков (~ 22 %), 2 онкологических больных до лечения и один контрольный донор. Третья группа - повышенная радиоповреждаемость ДНК при повышенном исходном уровне разрывов ДНК. В эту группу входят 5 летчиков (~ 12 %), один космонавт, одиннадцать онкобольных до лечения (65%) и все 6 онкобольных во время лечения. И, наконец, к четвертой группе с повышенным исходным уровнем разрывов ДНК и «нормальной» радиоповреждаемостью ДНК относится 1 летчик и 2 онкобольных до лечения. Для летчиков и космонавтов полученные данные могут иметь важное прогностическое значение. В случае онкологических больных важно установить чувствительность каждого больного к лечению. Все индивидуумы, не входящие в первую группу, а в особенности люди относящиеся к третьей группе, требуют тщательного медицинского обследования с привлечением молекулярно-биологических методов для выяснения детальных механизмов обнаруженных отклонений.

A Б Рис. 3. Распределение контрольных доноров, летчиков и космонавтов (А), а также контрольных доноров и онкологических больных (Б) по исходным уровням разрывов ДНК лимфоцитов и уровням разрывов ДНК после облучения лимфоцитов в дозе 1Гр. Пунктирные линии – границы 95 % доверительного интервала для контрольной группы. I – норма. II – повышенная радиоповреждаемость ДНК. III - повышенная радиоповреждаемость ДНК при повышенном исходном уровне разрывов ДНК. IV - повышенный исходный уровень разрывов ДНК.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»