WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Обратимость солюбилизации нмНДФК позволяет предположить, что аналогичный процесс может также протекать in vivo. В таком случае нмНДФК можно отнести к группе так называемых «непостоянных» периферических мембранных белков (Goi F.M., 2002).

Прочность связи нмНДФК с мембранами зависела от рН среды хранения (рис. 8). При кислых значениях рН фермент был менее прочно связан с мембранами, чем при щелочных. При этом часть молекул нмНДФК, активность которых составила ~ 20 % максимальной активности нмНДФК наружного компартмента, оставалась нечувствительной к действию рН. Дополнительные эксперименты показали, что уменьшение доли ассоциированной с мембранами активности нмНДФК в средах с кислым значением рН не было следствием инактивации фермента при этих значениях рН (не показано) и действия катепсинов (рис. 8).

Мы предположили, что солюбилизацию нмНДФК под влиянием рН можно обратить смещением рН среды хранения митохондрий в щелочную сторону. В этих экспериментах для ингибирования катепсинов использовали Е-64 - необратимый ингибитор цистеиновых протеиназ, суммарный заряд которого равен нулю. В качестве неспецифического субстрата для катепсинов к митохондриям добавляли БСА. На рис. 9, кривая 1, показана активность нмНДФК, связанная с мембранами митохондрий, промытых и хранившихся в среде с высокой ионной силой в присутствии 1 мМ MgCl2, при рН 8,0. В митохондриях, промытых и хранившихся в такой же среде при рН 6,0 в присутствии или без ингибиторов катепсинов, нмНДФК быстро солюбилизировалась (рис. 9, кривая 2).

Рис. 8. Влияние рН среды промывания и хранения митохондрий на солюбилизацию нмНДФК. Митохондрии промывали и хранили при указанных значениях рН в среде, содержащей 10 мМ MES (рН 6,0 – 7,0) или 10 мМ HEPES (рН 7,0 – 8,6), а также (1) – 140 мМ KCl, мМ MgCl2, 75 мкМ лейпептин, (2 - 4) – маннит до суммарной осмотической концентрации мосМ, KCl до суммарной ионной силы 0,009, (3) – 50 мкМ лейпептин.

(1 - 3) - Встряхивание в термомиксере – 2 ч; (4) - 4,8 ч.

Кривые 1 и 2 - субстрат UDP, кривые 3 и 4 - субстрат CDP. На кривых 1 и разными значками обозначены результаты отдельных экспериментов. (2 и 4) - Результаты одного эксперимента.

Через 2 ч хранения митохондрий при рН 6,0 к суспензиям добавили заранее подобранное количество 1М Tris, которое повышало рН среды хранения митохондрий до рН 8,0 (рис. 9, кривые 3 – 5). В присутствии смеси Е64 и БСА обращение солюбилизации нмНДФК (рис. 9, кривая 5) происходило до уровня максимальной активности фермента при рН 8,0 (рис. 9, кривая 1).

Таким образом, мы установили, что нмНДФК, солюбилизированная при кислых значениях рН, не теряет способности обратно связываться с мембранами митохондрий в присутствии ингибиторов протеиназ и БСА (рис. 9).

Рис. 9. Обращение солюбилизации нмНДФК изменением рН среды хранения. Среда промывания и хранения митохондрий содержала 140 мМ KCl, 1 мМ MgCl2 и (1) – 10 мМ HEPES, рН 8,0; (2 - 5) – 10 мМ MES, рН 6,0; а также:

(треугольники) - 10 мг/мл БСА, (ромбы) – мкМ Е-64, (квадраты) – БСА и Е-64, (кружки) – без добавок. (3 – 5) - Через 2 ч после получения осадка митохондрий к суспензиям добавили Tris (черные символы). (1) – общая относительная активность нмНДФК, (2 – 5) – связанная с мембранами. Пояснения – в тексте.

Принято считать, что рН цитоплазмы клеток печени равен 7,1-7,2 (Shapiro J.I., et al., 1990; Vidal G., et al., 1998). На рис. 8, кривая 1, видно, что при физиологических концентрациях ионов К+ и Mg2+ при указанных значениях рН связывание нмНДФК с мембранами митохондрий близко к максимально возможному. Следует, однако, учесть, что измерение рН цитоплазмы сталкивается с существенными трудностями. Некоторые авторы считают, что действительный рН цитоплазмы клеток ниже, чем это принято думать. Если это так, то во время протекания многих как физиологических, так и патологических процессов, например, интенсивной мышечной работе, голодании, гипоксии, ишемии, диабете, сопровождающихся ацидозом, изменения внутриклеточного рН могут эффективно изменять долю связанных с наружной мембраной митохондрий молекул нмНДФК.

Гетерогенность свойств солюбилизированной нмНДФК. Исследовали экстракт белков с поверхности митохондрий в среде с низкой ионной силой с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях. После окончания электрофореза отдельные дорожки геля окрашивали по активности НДФК.

После изоэлектрофокусирования трёхчасового экстракта белков с поверхности митохондрий в геле сформировался линейный градиент рН в диапазоне от 3,5 до 9 (не показано). При окрашивании по активности НДФК проявились две полосы с изоэлектрическими точками 5,1 (более интенсивная) и 5,5 (не показано).

Дальнейшие эксперименты показали, что число полос и соотношение интенсивности их окраски не зависели от присутствия лейпептина в среде промывания и хранения митохондрий, прединкубации белкового экстракта с субстратами НДФК (MgADP и MgATP) и времени экстрагирования белков с поверхности митохондрий (не показано). Полученные результаты позволили сделать вывод, что появление двух полос с активностью НДФК на электрофореграмме не было обусловлено действием катепсинов на молекулы нмНДФК и различной степенью фосфорилирования молекул фермента. Мы также сделали вывод, что две фракции нмНДФК, присутствующие в экстракте, солюбилизировались одновременно.

Рис. 10. Нативный электрофорез экстракта белков с поверхности митохондрий в градиенте плотности полиакриламидного геля. (1) Маркёрные белки; (2) экстракт белков с поверхности митохондрий, содержащий 0,19 ед. активности нмНДФК;

(3) - 0,19 ед. активности дНДФК. Окрашивание: (1) - Coomassie brilliant blue R-250;

(2 и 3) - по активности НДФК.

Нативный электрофорез в линейном градиенте плотности полиакриламидного геля (рис. 10) показал, что кажущаяся молекулярная масса дНДФК (рис. 10, дорожка 3) была равна 126 кДа, что хорошо соотносится с литературными данными для гексамера НДФК (Lacombe M.L., et al. 2000). На электрофореграмме экстракта белков с поверхности митохондрий проявились две полосы (рис. 10, дорожка 2). Полоса с кажущейся молекулярной массой кДа имела более интенсивную окраску, чем полоса 132 кДа (дорожка 2).

Мы предположили, что в экстракте белков с поверхности митохондрий нмНДФК может находиться в виде свободного гексамера или в комплексе с белком с кажущейся молекулярной массой ~ 70 кДа.

ВЫВОДЫ 1. Получены доказательства того, что вся НДФК наружного компартмента митохондрий локализована на внешней поверхности наружной митохондриальной мембраны.

2. Установлено, что прочность связи нмНДФК с мембранами митохондрий повышается с увеличением ионной силы и рН среды хранения митохондрий, а также в присутствии ионов Mg2+ и не зависит от присутствия ЭДТА.

3. При изучении функционального сопряжения активности нмНДФК с системой окислительного фосфорилирования установлено, что в присутствии избытка активности мышечной КК нмНДФК более эффективно поставляет ADP для системы окислительного фосфорилирования, чем дНДФК и дГК.

4. Установлено, что в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования участвует 22 – 24% активности нмНДФК.

5. Установлено, что солюбилизация из митохондрий нмНДФК, не участвующей в функциональном сопряжении, обратима. В зависимости от условий хранения митохондрий, солюбилизация может быть обращена добавлением Mg2+ или повышением рН среды хранения.

6. В экстракте белков с поверхности митохондрий присутствуют две фракции, обладающие нуклеозиддифосфаткиназной активностью и различающиеся кажущимися величинами молекулярных масс (132 и 204 кДа) и изоэлектрическими точками (5,1 и 5,5), соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Воинова В.В. (2004) Роль нуклеозиддифосфаткиназы наружного компартмента митохондрий печени в переносе ADP через наружную мембрану митохондрий. XI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2004», Москва, 12 - 15 апреля, издательство МГУ, 22-23.

2. Липская Т.Ю., Воинова В.В. (2005) Функциональное сопряжение между нуклеозиддифосфаткиназой наружного компартмента митохондрий и окислительным фосфорилированием, Биохимия, 70, 1646-1655.

3. Воинова В.В. (2006) Характер взаимодействия нуклеозиддифосфаткиназы наружного компартмента митохондрий с наружной митохондриальной мембраной и особенности её функционального сопряжения с системой окислительного фосфорилирования. XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2006», Москва, 12 – 15 апреля, МАКС-пресс, 47-48.

4. Voinova V.V., Lipskaya T.Yu. (2006) The role of nucleoside diphosphate kinase in ADP transport across the outer mitochondrial membrane, 31st FEBS Congress Molecules in Health and Disease, Istanbul, Turkey, 24 – 29 June, FEBS journal, 273, supplement 1, 59.

5. Voinova V.V., Lipskaya T.Yu. (2006) Some characteristics of functional coupling between nucleoside diphosphate kinase of the outer mitochondrial compartment and oxidative phosphorylation, XIV European Bioenergetics Conference, Moscow, Russia, 22 – 27 July, BBA, EBEC 2006 short reports, 14, 353-354.

6. Липская Т.Ю., Воинова В.В. (2008) Нуклеозиддифосфаткиназа митохондрий: характер взаимодействия с наружной митохондриальной мембраной и доля активности, функционально сопряженной с окислительным фосфорилированием, Биохимия, 73, 395-407.

7. Воинова В.В, Липская Т.Ю. (2008) Особенности свойств и функций нуклеозиддифосфаткиназы наружного компартмента митохондрий, XVI Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" IT+M&Ec, Гурзуф, Украина, 31 мая – 9 июня, издательство МЭСИ, 226 – 228.

8. Липская Т.Ю., Воинова В.В. (2009) Обратимость солюбилизации нуклеозиддифосфаткиназы с поверхности наружной мембраны митохондрий, Биохимия, 74, 710-720.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»