WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Осадок промывали в 0,15 М KCl для удаления цит. с из митохондрий с повреждёнными наружными мембранами и подвергали полярографическому исследованию. Было найдено, что за 10 ч хранения из митохондрий солюбилизировалось более чем 90% активности НДФК (не показано). На рис. 1, а, б видно, что в присутствии FCCP цит. с не увеличивал скорость дыхания таких митохондрий, но он стимулировал дыхание митохондрий, наружная мембрана которых была повреждена в результате гипотонической обработки (рис. 1, в). Из этих опытов мы сделали вывод, что вся солюбилизированная активность НДФК была связана с внешней поверхностью наружной мембраны митохондрий.

Рис. 1. Солюбилизация цит. с во время хранения митохондрий. а) – Исходная суспензия митохондрий после 10 ч хранения во льду; б) – суспензия митохондрий после 10 ч хранения и промывания в 0,15 М KCl; в) – суспензия митохондрий после предварительной гипотонической обработки в 0,015 М KCl и промывания в 0,15 М KCl. Где указано, были добавлены 0,5 мкМ FCCP и мкг цит. с. Представлены результаты одного из двух аналогичных экспериментов.

Природа сил взаимодействия нмНДФК с мембранами. При изучении функционального сопряжения активности нмНДФК с окислительным фосфорилированием важно было иметь уверенность, что во время опыта нмНДФК прочно связана с наружной мембраной митохондрий. Для того чтобы найти условия выделения и хранения митохондрий, удовлетворяющие этому требованию, мы изучили природу сил взаимодействия нмНДФК с мембранами. С этой целью исследовали зависимость солюбилизации нмНДФК от концентрации KCl в среде промывания (рис. 2).

На рис. 2 видно, что повышение ионной силы среды промывания и хранения митохондрий увеличивало прочность связи нмНДФК с мембранами. Мы сделали вывод, что ионные взаимодействия не играют существенной роли в связывании фермента с мембранами митохондрий. Мы установили, что замена K+ на Na+ не влияла на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами (не показано).

Следовательно, влияние K+ и Na+ было обусловлено неспецифическим действием ионной силы на связывание фермента.

Рис. 2. Влияние концентрации KCl в среде промывания митохондрий на прочность связи нмНДФК с мембранами. Осадки митохондрий суспендировали в средах промывания, содержащих указанные количества KCl, 2,1 мМ HEPES, pH 7,4 и маннит до суммарной осмотической концентрации 280 мосМ. Через 1 ч суспензию центрифугировали и определяли в осадках оставшуюся активность нмНДФК.

За 100% принимали отношение VCDP/VADP, найденное для митохондрий, инкубированных в среде промывания, содержащей 140 мМ KCl (в этих опытах это отношение было равно 69,0 ± 0,9%). За 0% принимали отношение VCDP/VADP, найденное для митохондрий, инкубированных в среде с низкой ионной силой (это отношение было равно 34,5 ± 0,2%). n=2.

Присутствие Mg2+ в среде хранения митохондрий способствовало прочному связыванию нмНДФК с мембранами. Можно было предположить, что Mg2+ непосредственно участвует в связывании фермента. Однако промывание митохондрий при рН 8,0 в присутствии 1 мМ ЭДТА не вызывало дополнительную солюбилизацию нмНДФК (не показано). Мы сделали вывод, что Mg2+ не участвует напрямую в связывании нмНДФК с мембранами.

Солюбилизация нмНДФК из митохондрий, хранившихся в разных средах. Исследовали функциональные характеристики и скорость солюбилизации нмНДФК из митохондрий, хранившихся в средах, содержавших 2,1 мМ HEPES, рН 7,4, а также: 280 мМ маннит (среда с низкой ионной силой); 140 мМ KCl (среда с высокой ионной силой); 3,33 мМ MgCl2 и 270 мМ маннит (среда с Mg2+).

Основные функциональные характеристики митохондрий сразу после их получения и через 5 – 8 ч хранения практически не различались (не показано).

Следовательно, условия выделения и хранения митохондрий не оказывали какого-либо воздействия на их дыхательный аппарат. Однако прочность связи нмНДФК с мембранами в анализируемых препаратах существенно различалась (рис. 3, кривые 2). Из митохондрий, хранившихся в среде с низкой ионной силой, нмНДФК легко солюбилизировалась, в среде с высокой ионной силой солюбилизация фермента происходила медленнее, а в среде с Mg2+ 90% активности нмНДФК оставались связанными с мембранами в течение 6 ч. Суммарная активность солюбилизированной и связанной с мембранами нмНДФК практически не изменялась во времени (кривые 1), хотя исходно она была разной величины, поскольку часть нмНДФК солюбилизировалась в процессе выделения митохондрий. Доля Рис. 3. Солюбилизация нмНДФК при хранении митохондрий в разных средах.

утраченной при выделении Митохондрии промывали и хранили: (а) - в активности нмНДФК определялась среде с низкой ионной силой; (б) - в среде с высокой ионной силой; (в) - в среде с Mg2+.

солюбилизирующим эффектом среды Относительная активность нмНДФК: (1) - общая; (2) – связанная с мембранами. (а, б) - промывания.

Результаты отдельных экспериментов; (в) - средние результаты трёх независимых экспериментов.

Поскольку в среде с Mg2+ связанная с мембранами активность нмНДФК оставалась на постоянном высоком уровне в течение 6 ч (рис. 3, в, кривая 2), мы использовали этот препарат в опытах по изучению функционального сопряжения активности нмНДФК с окислительным фосфорилированием.

Функциональное сопряжение активности нмНДФК с окислительным фосфорилированием. На рис. 4. представлены схемы трёх ферментных систем, использованных в опытах. В первой системе (рис. 4, а) донором ADP для окислительного фосфорилирования служила нмНДФК, связанная на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий, а в двух других системах – не способные связываться с мембранами дрожжевая гексокиназа (дГК) (рис. 4, б) и дрожжевая НДФК (дНДФК) (рис. 4, в). Роль внешней ADP-потребляющей системы, конкурирующей за ADP с системой окислительного фосфорилирования, играла мышечная КК.

Рис. 4. Три экспериментальные модели, использованные в работе. ВМ и НМ – внутренняя и наружная мембраны митохондрий соответственно, ММП – межмембранное пространство. Кр – креатин, КрФ – креатинфосфат, Гл – глюкоза, Гл-6-Ф – глюкозо-6фосфат, дГК – дрожжевая ГК, дНДФК – дрожжевая НДФК.

На рис. 5 представлены результаты измерения скорости дыхания митохондрий в присутствии возрастающих количеств КК в двух ферментных системах: с нмНДФК (рис. 4, а) и с дГК (рис. 4, б). В отсутствие КК добавление 600 мкМ CDP вызывало такую же стимуляцию дыхания, как и добавление предварительно подобранного количества дГК, то есть активности нмНДФК и дГК в экспериментальных системах были равны (рис. 5). Однако при увеличении количества добавленной КК скорость дыхания в системе с активной нмНДФК снижалась медленнее, чем в системе с активной дГК (рис. 5, кривые 1 и 2 соответственно). В присутствии 20,5 ед./мл КК скорости дыхания митохондрий в обеих системах достигли минимума и далее практически не менялись. В этих условиях активность КК в 60–100 раз превышала максимальную скорость окислительного фосфорилирования.

Рис. 5. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени от активности КК.

Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала 1 мМ ATP, 6,2 мМ КФ, 20 мкМ AP5A (кружки), а также 5 мМ глюкозу (треугольники). (1) – скорость дыхания после добавления CDP; (2) – скорость дыхания после добавления дГК; (и 4) – скорости дыхания митохондрий до добавления CDP или дГК соответственно.

n=3.

Трудность работы с нмНДФК заключалась в том, что в состав сопряженной ферментной системы, используемой для определения концентрации ADP спектрофотометрическим методом, входит пируваткиназа, которая не обладает строгой субстратной специфичностью по отношению к нуклеотидам и может, наряду с ADP, потреблять другие присутствующие в среде субстраты нмНДФК. По этой причине мы не могли напрямую определить концентрацию ADP в пробах, содержащих CDP, спектрофотометрическим методом. Однако применение КК в полярографическом опыте позволило нам решить эту проблему.

Поскольку креатинкиназная реакция легко обратима, в пробах полярографического опыта при условии избытка активности КК по сравнению с активностью другой киназы и скоростью окислительного фосфорилирования устанавливалось квазиравновесие креатинкиназной реакции. В системе с дГК мы определяли концентрации всех участников креатинкиназной реакции и находили величину отношения их действующих масс (Г = [ADP] · [КФ] / [ATP] · [Кр]) (табл. 1) которая при активности КК 20,5 ед./мл была равна кажущейся константе равновесия этой реакции. Найденная величина кажущейся константы равновесия креатинкиназной реакции хорошо соотносится с данными литературы (например, Lawson J.W., et al., 1979; Lipskaya T.Yu., et al., 1989). В наших опытах активности дГК и нмНДФК были равны, следовательно, в условиях квазиравновесия креатинкиназной реакции отношение действующих масс её участников в этих системах также должно было быть одинаковым. В системе с нмНДФК определяли концентрации креатина, креатинфосфата и АТР, и, зная величину кажущейся константы равновесия, рассчитывали концентрацию ADP.

В наших опытах субстрат дыхания (сукцинат) и Pi присутствовали в избытке. В этих условиях скорость дыхания митохондрий зависела от концентраций ADP и ATP в среде (Kunz W., et al., 1981). В присутствии избытка активности КК во время работы нмНДФК остаточная скорость дыхания митохондрий была равна 21% исходной, а во время активности дГК – 7% (табл. 1), хотя наружная концентрация ADP и отношение ATP/ADP в обеих системах достоверно не различались (табл. 1).

Таблица 1. Параметры, характеризующие состояние квазиравновесия креатинкиназной реакции во время активности дГК и нмНДФК.

Скорость фосфорилирующего дыхания - КК + КК Активный Г = [ADP]·[КФ]/ ADP, нмоль О2/мин нмоль О2/мин фермент /[АТР]·[Кр] мкМ АТР/ADP на 1 мг белка % на 1 мг белка % дГК 0,0259 ± 0,002 (10) 3,22 ± 0,49 (11) 288 ± 36 (11) 73,3 ± 5,6 (3) 100 5,3 ± 0,5 (12) нмНДФК --- 3,16 ± 0,25 (10) 311 ± 0,25 (10) 72,4 ± 5,4 (3) 100 15,0 ± 0,8 (12) Примечание. Расчёт по результатам трёх опытов. В присутствии КК результаты усреднены для проб, в которых концентрация КК была равна 20,5 – 34,1 ед./мл. В скобках – число измерений.

При сравнении активности нмНДФК и дНДФК в присутствии избытка активности КК установлено, что остаточная скорость фосфорилирующего дыхания во время активности нмНДФК составила 23% исходной, а во время активности дНДФК – только 3% (в опытах с дНДФК нмНДФК была предварительно солюбилизирована с поверхности митохондрий).

Полученные результаты свидетельствуют о возникновении функционального сопряжения между нмНДФК и системой окислительного фосфорилирования во время их активности. Насколько нам известно, эти результаты для нмНДФК получены впервые.

Доля активности нмНДФК, сопряженной с окислительным фосфорилированием. Все ли молекулы нмНДФК принимают участие в функциональном сопряжении с окислительным фосфорилированием На рис. видно, что в ходе хранения митохондрий в среде с высокой ионной силой за 5 ч доля активности связанной с мембранами нмНДФК значительно уменьшилась (рис. 6, кривая 2). Однако доля фосфорилирующего дыхания, нечувствительного к присутствию избытка активности КК, была постоянной и составила ~17% скорости окислительного фосфорилирования (рис. 6, кривая 3).

Рис. 6. Доля нмНДФК, участвующая в функциональном сопряжении с окислительным фосфорилированием. Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала 1 мМ ATP, 20 мкМ АР5А (1 и 2), а также 6,2 мМ КФ, 22,5-ед./мл КК (3) и 5 мМ глюкозу (4). (1 – 3) – скорость дыхания после добавления CDP; (4) – скорость дыхания после добавление дГК. (1, 3, 4) - Исходная суспензия митохондрий; (2) - суспензия осадка митохондрий после переосаждения в среде хранения. (кривые 1-3) n = 6; (кривая 4) n = 3. За 100% принимали исходную скорость фосфорилирующего дыхания VADP=85,3 ± 10,0 нмоль О2/мин на 1 мг белка.

Такая же доля нечувствительного к присутствию избытка активности КК фосфорилирующего дыхания была получена при хранении митохондрий в среде с Mg2+ (не показано), хотя в течение 5 ч хранения практически вся нмНДФК оставалась связанной с мембранами (рис. 3, в).

Мы сделали вывод, что в функциональном сопряжении участвует только небольшая доля наиболее прочно связанных с мембранами митохондрий молекул нмНДФК, активность которых составила 22 – 24% общей активности фермента. Мы предполагаем, что в функциональное сопряжение вовлечены те молекулы нмНДФК, которые локализованы в области контактных участков поверхностных мембран митохондрий, где они связаны с порином или находятся поблизости от него.

В наших опытах 10% декстран не влиял на функциональное сопряжение между активностью нмНДФК и окислительным фосфорилированием, хотя он увеличивал функциональное сопряжение между активностью мАК и окислительным фосфорилированием в митохондриях, хранившихся в среде без Mg2+ (не показано).

Обращение солюбилизации нмНДФК. Мы предположили, что солюбилизация молекул нмНДФК, не участвующих в сопряжении с окислительным фосфорилированием (см. рис. 6, кривая 2), функционально значима и может происходить in vivo. В таком случае солюбилизация нмНДФК должна быть обратимой. Добавление Mg2+ к митохондриям, хранившимся в течение 30 мин в среде с низкой ионной силой, вызывало обращение солюбилизации нмНДФК, при этом связанная с мембранами активность нмНДФК возрастала до 86% от максимальной. Однако обращение солюбилизации было неустойчивым, и доля мембраносвязанного фермента через короткое время снижалась (не показано). Мы предположили, что неполное обращение солюбилизации нмНДФК связано с активностью протеолитических ферментов – катепсинов. Для проверки этого предположения в среду промывания и хранения митохондрий добавили 50 мкМ лейпептин - ингибитор сериновых и цистеиновых протеиназ (рис. 7). Контрольные опыты показали, что лейпептин не влиял на скорость солюбилизации нмНДФК во время хранения митохондрий (не показано).

На рис. 7 видно, что нмНДФК быстро солюбилизировалась (кривая 2).

Добавление 3,33 мМ MgCl2 к митохондриям, промытым и хранившимся в присутствии 50 мкМ лейпептина (кривая 3) приводило к устойчивому обращению солюбилизации нмНДФК, при этом мембраносвязанная активность фермента увеличилась до 90% максимальной.

Рис. 7. Влияние лейпептина на обращение солюбилизации нмНДФК добавлением Mg2+.

Одинаковые осадки митохондрий промывали и хранили в среде с низкой ионной силой (кружки) - без лейпептина; (ромбы) - с добавлением 50 мкМ лейпептина. 3,33 мМ MgClбыл добавлен к суспензиям с лейпептином через 1 ч после получения препарата митохондрий.

Относительная активность нмНДФК:

(1) - общая; (2) – связанная с мембранами. Представлены результаты одного из трёх аналогичных экспериментов.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»