WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

В разделе 2.1. перечислены и описаны используемые в данной работе реактивы. Раздел 2.2. посвящен описанию моделирования региональной ишемии сердца крысы в условиях in vivo. Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Wistar. Крысы были наркотизированы внутрибрюшинно этаминалом натрия, после чего им был имплантирован катетер в бедренную артерию для наблюдения АД и ЧСС, и в яремную вену для последующего добавления наркоза и окрашивания зоны риска. Животным производилась трахеостомия, после чего животные подключались к аппарату искусственной вентиляции легких.

Региональная ишемия миокарда вызывалась перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия в условиях вскрытой грудной клетки. В разделе 2.3. описана методика проведения гель электрофореза ДНК кардиомиоцитов ткани миокарда после ишемии/реперфузии.

Раздел 2.4. посвящен описанию методики синтеза S-нитрозотиолов и ДНКЖ Концентрацию GSNO, CysNO и ДНКЖ определяли методом спектроскопии ЭПР. В разделе 2.5. описана методика свободнорадикального окисление гомогената миокарда крыс. Сердца крыс линии Wistar измельчались, смешивались с 40 мМ Na,Kфосфатным буфером (рН 7.4) и гомогенизировались в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком до получения однородной массы. Окисление гомогената миокарда инициировали добавлением гидропероксида трет-бутила и метмиоглобина или метгемоглобина. Перед окислением в гомогенат добавлялись различные концентрации PAPA/NONO, соли Ангели, GSNO, CysNO, NaNO2 и ДНКЖ. Раздел 2.6. посвящен описанию методики определения ТБК-реактивных продуктов. Для определения концентрации ТБК-реактивных продуктов отбирались аликвоты гомогената миокарда (1мл), окисление в которых останавливалось добавлением BHT и ДТПА. Аликвоты препаратов миокарда добавлялись к 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67% раствор ТБК, после чего смесь помещалась в водяную баню на 30 мин. После этого образцы охлаждались и центрифугировались.

Измерение вторичных продуктов перекисного окисления (ТБК-реактивных продуктов) проводилось в надосадке по оптическому поглощению при 532 нм ( = 1,5 -1 -.

10 М см ), в качестве базовой линии использовался отрезок спектра между 515-нм. В разделе 2.7. описана методика определения концентрации коэнзимов Q9 и Q10 в гомогенате ткани с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Раздел 2.8. посвящен методике регистрации и обработки спектров ЭПР. Регистрацию спектров ДНКЖ проводили при комнатной температуре (~25°С) и температуре жидкого азота (-196°С). Аликвоты образцов гомогената (300 мкл) замораживали в жидком азоте, помещали в кварцевый дьюар в резонаторе спектрометра ЭПР, после чего записывали спектры при СВЧ мощности 10 мВт, СВ частоте 9,33 ГГц, амплитуде ВЧ модуляции 0,2 мТл. В разделе 2.9. описана методика получения изолированных митохондрии сердца крысы. Раздел 2.10. посвящен описанию экспериментов по изучению влияния аторвастатина и коэнзима Q на свободнорадикальную резистентность миокарда.

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя приложения программы Origin 7.0 фирмы Microcal Software, Inc. (США).

Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

В третьей главе представлены непосредственно результаты исследований.

В разделе 3.1. приведены результаты исследования влияния ишемии различной длительности, на баланс запрограммированной (апоптоз) и некротической гибели кардиомиоцитов на модели региональной ишемии/реперфузии сердца крысы in vivo. Наркотизированные самцы крысы линии Wistar были подвергнуты 15-минутной или 25-минутной региональной ишемии миокарда в условиях вскрытой грудной клетки и искусственной вентиляции легких. Баланс апоптической и некротической гибели клеток миокарда оценивали по присутствию на негативах гель электрофореза ДНК характерной для апоптоза «лесенки» и характерной для некроза размытой, диффузионной структуры. Как видно из рисунка 1a характерная для a b запрограммированной клеточной гибели «лесенка» ДНК наиболее четко проявилась в Рис. 1. Гель электрофорез ДНК, образцах миокарда после 15-минутной выделенной из зоны риска миокарда крыс после 15-минутной (a) и 25ишемии и последующей трехчасовой минутной экспериментальной реперфузии. Действительно, работа ишемии (b). Реперфузия в обеих группах проходила в течение специфической для апоптоза эндонуклеазы часов.

CAD приводит к разрезанию ДНК апоптической клетки на фрагменты кратные 180 п.о. Диффузионный тип разрушения ДНК характерный для некроза проявляется в виде сплошной, размытой структуры при гель электрофорезе. Подобную структуру можно наблюдать в случае 25-минутной ишемии (рис. 1 b). Кроме того, в группе животных подвергшихся 15-минутной экспериментальной ишемии ДНК миокарда в целом была менее подвержена деградации. Следует отметить, что расщепление ДНК на фрагменты, кратные 180 п.о. является одним из наиболее поздних событий при апоптической гибели клетки. Формирование «лесенки» при гель электрофорезе ДНК из образцов миокарда свидетельствует о большом количестве клеток, дошедших до стадии расщепления ДНК, не подвергшихся при этом гибели по механизму некроза. Действительно, прохождение полного цикла реакций, характерных для апоптоза, требуют целостности клетки и определенного значения внутриклеточной концентрации АТФ.

Известно, что длительность ишемии влияет на образование АФК в ткани миокарда при последующей реперфузии. Было показано, что увеличение длительности ишемии приводит к значительному увеличению синтеза гидроксильно радикала в миокарде на модели региональной ишемии сердца крысы in vivo.

1,Также показано, что увеличение длительности ишемии усиливает (2) 0,(1) образование АФК митохондриями выделенными из миокарда.

0 20 40 60 80 100 a Инкубация, мин.

Можно предположить, что после 15 мин. ишемии миокарда при последующей реперфузии 1,происходит образование АФК, достаточное для активации 0,2 запрограммированной клеточной 0 3 4 гибели, при этом степень 0 30 b свободнорадикального Инкубация, мин.

повреждения такова, что не Рис. 2. Ингибирование индуцированного происходит развитие процесса гидропероксидом трет-бутила (40 мкМ) и метмиоглобином (30 мкМ) ПОЛ гомогената гибели клетки по механизму миокарда крысы в присутствии различных концентраций PAPA/NONO. Рис. 2a, кривая (1) некроза. Таким образом, – концентрация PAPA/NONO равна 100 мкМ, экспериментальная 15-минутная кривая (2) – контроль. Рис. 2b: (0) – контроль;

(1),(2),(3),(4) – PAPA/NONO в концентрации ишемия является вполне 800, 400, 200, 100 мкМ, соответственно.

корректной моделью для исследования апоптоза кардиомиоцитов на ранних этапах реперфузии при моделировании региональной ишемии сердца в условиях in vivo. Необходимо отметить, что полученные данные справедливы для использованной нами модели и могут отличаться в других моделях. Однако, можно предположить, что сдвижение баланса в сторону запрограмированной гибели клетки будет происходить и в других моделях при уменьшении длительности экспериментальной ишемии.

В разделе 3.2. представлены экспериментальные данные по изучению влияния синтетических доноров оксида азота и нитроксильного аниона на мкМ Концентрация ТБК реактивных продуктов, мкМ Концентрация ТБК реактивных продуктов, образование ТБК-реактивных продуктов в процессе свободнорадикального окисления гомогената миокарда крысы индуцированного метмиоглобином и 2,гидроперероксидом третбутила. На рисунке 2 представлены кинетические 1,кривые образование ТБКреактивных продуктов в нашей (1) 0,системе. Как видно из рис. 2а, (2) синтетический донор оксида a 0 20 40 60 80 100 азота PAPA/NONO эффективно Инкубация, мин.

дозозависимо ингибировал образование продуктов ПОЛ в 1,нашей системе. Уже в концентрации 100 мкМ (рис. 2b) этот донор оксида азота 0,5 1 3 0 значительно уменьшал образование ТБК-реактивных 0 30 Инкубация, мин.

b продуктов. Можно предположить, что Рис. 3. Ингибирование индуцированного ингибирование ПОЛ в гидропероксидом трет-бутила (40 мкМ) и метмиоглобином (30 мкМ) ПОЛ гомогената использованной нами миокарда крысы в присутствии различных модельной системе обусловлено концентраций соли Ангели (СА). Рис.3a – (1) контроль, (2) - СА 200 мкМ. Рис. 3b – (0) способностью оксида азота и его контроль, (1), (2), (3), (4),- 800, 400, 200, мкМ СА.

метаболитов взаимодействовать с пероксильными и алкоксильными радикалами липидов с образованием нитроперокси- и нитропроизводных. Известно, что в результате таких реакций обрываются цепные реакции свободнорадикального окисления. В ряде работ показано, что оксид азота может восстанавливать оксоферрил форму миоглобина (гем-Fe(IV)=O), образующуюся при взаимодействии метмиоглобина с гидроперекисями. Этот механизм также может вносить свой вклад в наблюдаемый нами антиоксидантный эффект PAPA/NONO.

продуктов, мкМ Концентрация ТБК реактивных Ко н ц ен тр аци я ТБК р еак ти вн ы х п р о дук то в, мк М Соль Ангели (Na2N2O3), являющая источником нитроксильного аниона, также дозозависимо ингибирует ПОЛ в гомогенате миокарда (рис.3). В настоящее время в литературе описано только цитотоксическое влияние соли Ангели в системах моделирующих ишемическое и свободнорадикальное повреждение органов и клеток.

(0) 2,Предполагается, что в реакции (1) между нитроксильным анионом и (2) (3) кислородом образуется 1,пероксинитрит, проявляющий различные цитотоксические 0,эффекты. Известно, что в реакции распада соли Ангели 0 20 40 60 80 100 образуются эквимолярные Инкубация, мин.

количества NO- и нитрит аниона Рис. 4. Кинетические кривые образования ТБК-реактивных продуктов при Можно предположить, что нитрит индуцированном метмиоглобином и анион способен оказать гидропероксидом трет-бутила ПОЛ гомогената миокарда крысы в присутствии антиоксидантный эффект в нашей различных концентраций связанных с декстраном ДНКЖ с цистеиновыми модели. Однако, в отличие от лигандами. (0) – без добавок, (1), (2), (3),- соли Ангели, оказавшей сильный концентрации ДНКЖ равные 150, 100, мкМ соответственно.

антиоксидантный эффект в концентрации 200 мкМ, нитрит анион в этой же концентрации не оказал влияние на образование ТБК-реактивных продуктов Полученные результаты позволяют предположить, что в гомогенате миокарда нитроксильный анион окисляется с образованием нейтральной молекулы NO, и соответственно, прооксидантный эффект нитроксильного аниона инвертируется в антиоксидантный.

В разделе 3.3. представлены результаты исследования антиоксидантных и прооксидантных свойств физиологических доноров и метаболитов оксида азота.

Представлены кинетические кривые образования ТБК-реактивных продуктов при индуцированном метмиоглобином и гидропероксидом трет-бутила ПОЛ гомогената миокарда крысы в присутствии GSNO и СysNO. Оба нитрозотиола эффективно ингибируют перекисное окисление липидов в нашей системе. S Концентрация ТБК реактивных продуктов мкМ нитрозоглютатион дозозависимо ингибирует ПОЛ, при этом максимальный антиоксидантный эффект наблюдается при наибольшей использованной концентрации GSNO равной 800 мкМ. Интересно, что при малых концентрациях (50-200 мкМ) GSNO не проявляет антиоксидантного эффекта.

Показано, что в гомогенате миокарда, вследствие остаточной работы ферментов происходит образование супероксидного анион-радикала. При этом при инкубации гомогената миокарда без гидроперекиси трет-бутила не происходит образования ТБКреактивных продуктов. Таким образом, можно предположить, что Рис.5. Кинетика деструкции связанных с образующийся в нашей системе в декстраном цистеиновых ДНКЖ (100 мкМ) в ходе свободнорадикального перекисного небольших количествах окисления гомогената миокарда крысы индуцированного метмиоглобином и супероксидный анион-радикал гидропероксидом трет-бутила. На вставке эффективно удалялся собственной приведен характерный спектр ЭПР ДНКЖ в замороженном при –196°С гомогенате.

системой антиоксидантной защиты.

При этом в группах с GSNO происходила конкурентная реакция NO. с O2.-, продуктом которой может быть пероксинитрит. Вероятно, именно образование пероксинитрита в наших экспериментах является причиной отсутствия антиоксидантного действия низких концентраций GSNO. Как и нитрозотиолы, динитрозильные комплексы железа являются внутриклеточными депо оксида азота. В нашей системе мы исследовали влияние ДНКЖ с цистеиновыми лигандами на образование ТБК-реактивных продуктов. На рисунке представлены кинетические кривые образования ТБК-реактивных продуктов при индуцированном метмиоглобином и гидропероксидом трет-бутила ПОЛ гомогената миокарда крысы в присутствии различных концентраций связанных с декстраном ДНКЖ с цистеиновыми лигандами. ДНКЖ проявили сильный антиоксидантный эффект. Уже в концентрации равной 150 мкМ данный реактив практически полностью ингибировал образование ТБК-реактивных продуктов в нашей системе. Можно предположить, что ингибирование ПОЛ в использованной нами модельной системе обусловлено способностью оксида азота высвобождающегося при деструкции ДНКЖ взаимодействовать с пероксильными и алкоксильными радикалами липидов с образованием нитроперокси - и нитропроизводных. С этим предположением согласуется то, что в используемой нами модели свободно-радикального окисления снижение ЭПР-детектируемой концентрации связанных с декстраном ДНКЖ коррелировало с их антиоксидантным действием (рис. 5).

В тоже время цистеиновые ДНКЖ без декстрана вызывают усиление ПОЛ в гомогенате миокарда (рис. 6, кривая 2). Обнаруженное противоречие в действии разных типов динитрозильных комплексов железа, по-видимому, обусловлено высвобождением в ходе их деструкции ионов железа и цистеина, катализирующих перекисное окисление и реакции Фентона и Хабера-Вайса.

Действительно свободный цистеин стимулировал индуцированное миоглобином и гидропероксидом Рис. 6. Усиление образования ТБКтрет-бутила свободнорадикальное реактивных продуктов под действием мкМ цистеиновых ДНКЖ (2), 2,5 мМ окисление гомогената миокарда свободного цистеина (3) или сочетания (рис. 6, кривая 3), причем при мкМ цистеиновых ДНКЖ и 2,5 мМ цистеина (4). Кривая (1) – без добавок.

добавлении избытка цистеина, вместе с ДНКЖ их прооксидантное действие также возрастает (рис.6, кривая 4).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»