WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Показано, что конечный препарат белка mRFP1 - это ансамбль молекул с ЛДА парой, состоящий из трех подансамблей, молекулы которых условно обозначаются как R, G и B формы белка. Действием внешних факторов (изменением кислотности раствора и облучением светом с длиной волны 488 нм (п. 3.4.2)) можно сократить количество форм белка до двух (R и G или R и B).

В п. 3.4.3 разработан метод, основанный на совместном применении абсорбционной спектроскопии и наносекундной лазерной флуориметрии с возбуждением на длине волны 532 нм. Метод позволил сформировать первый блок информации, описывающий фотофизические процессы в подансамблях ЛДА пар белка mRFP1, а именно, индивидуальные фотофизические параметры акцептора ЛДА пары (хромофора белка) в каждой из трех форм белка: сечение поглощения, квантовый выход в триплетное состояние (только для R формы), квантовый выход флуоресценции (только для R формы) и время затухания флуоресценции (только для R формы). Помимо этого, определяется соотношение концентраций молекул трех подансамблей ЛДА пар в общем препарате белка.

Разработанный метод имеет практическое значение как метод контроля направленного мутагенеза mRFP1 и поиска мутантов белка с необходимыми для конкретных применений оптическими свойствами. Информация, получаемая методом, также необходима для определения остальных фотофизических параметров (п. 3.4.5), фигурирующих в предложенной модели коллективных состояний (1).

В п. 3.4.4 изложенный в п. 3.4.3 метод применен для определения влияния на соотношение концентраций и индивидуальные фотофизические параметры хромофора белка mRFP1 точечных мутаций по 66 положению:

белки mRFP1/Q66S и mRFP1/Q66C. Показано, что индивидуальные значения коэффициентов экстинкции хромофоров коррелируют с объемами боковых радикалов по 66 положению (коэффициент корреляции >0.9).

В п. 3.4.5 развит метод, формирующий второй блок информации, описывающей фотофизическаие процессы в подансамблях ЛДА пар белка mRFP1, а именно, скорости переноса энергии с донора на акцептор в ЛДА паре каждой из трех форм белка и время внутрихромофорной релаксации донора (для B и G форм). Для этого разработанный в п. 3.4.3 метод был дополнен измерениями кривых насыщения и кинетических кривых (с пикосекундным возбуждением) при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 266 нм.

Регистрация флуоресценции при этом производилась в УФ (флуоресценция акцептора ЛДА пары, максимум на 330 нм) и видимой областях спектра (флуоресценция донора ЛДА пары, максимум на 607 нм). Для уменьшения числа одновременно присутствующих в растворе форм белка (для облегчения анализа данных лазерной флуориметрии) применялась процедура, предложенная в п.п. 3.4.2, 3.4.3. Полученные кривые насыщения изображены на рис. 3 (для случая раствора с R и B формами). Определенные фотофизические параметры представлены в таблице 2.

Рис. 3. Кривые насыщения донора (круги) и акцептора (квадраты) в белке mRFP1 для R и B форм.

Таблица 2. Значения фотофизических параметров ЛДА пар белка mRFP1.

Параметр* Значение Значение Значение параметра для параметра для параметра для R формы B формы G формы D(ex=266), 10-16 см2 1±0.KDA, 109 с-3.7±0.7 7.8±1 2.5±0.E 0.89 0.94 0.3A, нс 3±1 1.9±0.4 1.7±0.* в таблице:

- ( =266) – сечение поглощения донора на длине волны 266нм;

D ex - KDA и Е – скорость и эффективность переноса энергии с донора на акцептор;

A - – время жизни возбужденного состояния акцептора.

В заключении сформулированы основные результаты работы.

1. Методом лазерной флуориметрии, использующим согласованно наносекундную кинетическую и нелинейную флуориметрию, одновременно определены значения фотофизических параметров молекул триптофана в воде: сечений поглощения в основном и возбужденном синглетном состояниях, времени жизни возбужденного состояния, суммы скоростей интеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации из возбужденного синглетного состояния. Определены значения фотофизических параметров триптофана в однофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека: сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости интеркомбинационной конверсии.

2. На основе совместного применения абсорбционной спектроскопии, классической и нелинейной лазерной флуориметрии разработан метод определения индивидуальных фотофизических параметров (сечения поглощения, скорости интеркомбинационной конверсии, времени жизни возбужденного состояния) флуоресцирующего хромофора флуоресцентного белка mRFP1 и родственных ему флуоресцентных белков. Метод позволяет также определять долю флуоресцирующего хромофора в смеси хромопротеинов.

3. Введено понятие коллективных состояний локализованных донорноакцепторных пар (ЛДА пар). Предложена модель, описывающая кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющая рассчитывать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамблей ЛДА пар при лазерном возбуждении.

4. Предложена методика определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА паре, основанная на совместном применении нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии. Методика применена к растворам двухтриптофанового белка бычьего сывороточного альбумина и флуоресцентного белка mRFP1. Установлена схема фотофизических процессов в них как в представителях систем с локализованными донорноакцепторными парами. Определены значения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров (хромофоров) указанных белков:

сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости внутримолекулярного переноса энергии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Банишев А.А., Маслов Д.В., Фадеев В.В. Наносекундный лазерный флуорометр. // Приборы и техника эксперимента, 2006, №3, с. 143-148.

2. Банишев А.А., Вржещ Е.П., Дмитриенко Д.В., Друца В.Л., Маслов Д.В., Пащенко В.З., Ширшин Е.А., Вржещ П.В., Фадеев В.В. Метод определения индивидуальных оптических характеристик посттрансляционных флуоресцентных форм флуоресцентных белков с использованием нелинейной флуориметрии. // Биофизика, 2007, т. 52, №.5, с.792-798.

3. Банишев А.А., Ширшин Е.А, Фадеев В.В. Определение фотофизических параметров молекул триптофана методами лазерной флуориметрии. // Квантовая электроника, 2008, т. 38, №1, с. 77-81.

4. Банишев А.А., Маслов Д.В., Фадеев В.В. Определение квантового выхода синглет-триплетной конверсии в молекулах сложных органических соединений методом нелинейной лазерной флуориметрии. // Вестник Московского Университета. Серия 3. Физика, астрономия, 2008, №3, с.69-71.

5. Банишев А.А., Маслов Д.В., Мешканцов А.А., Остроумов Е.Е., Фадеев В.В. Кинетическая флуориметрия природных вод. // Сб. статей «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М.:

МАКСПресс, 2005, №12, с.138-147.

6. Ostroumov E.E., Banishev A.A., Fadeev V.V., Maslov D.V. Determination of photophysical parameters of organic compounds and their complexes by methods of laser fluorimetry. // Conference on Spectroscopy, Dublin, Ireland, 4-6 April, 2005, Conf. Digest, p.80.

7. Fadeev V.V., Dolenko T.A., Banishev A.A., Litvinov P.N., Maslov D.V., Ostroumov E.E. Matrix method in laser fluorimetry of organic compounds. // Proc. of SPIE, Opto-Ireland 2005: Optical Sensing and Spectroscopy, 2005, v. 5826, p.44-55.

8. Банишев А.А., Маслов Д.В., Литвинов П.Н. Определение фотофизических параметров сложных органических соединений методом лазерной флуориметрии. // Труды четвертой международной конференции молодых ученых и специалистов “Оптика-2005”, СанктПетербург, Россия, 2005, c.306-307.

9. Фадеев В.В., Вржещ П.В., Маслов Д.В., Банишев А.А., Вржещ Е.П., Дмитриенко Д.В., Ширшин Е.А. Флуоресцентные характеристики и молекулярные фотофизические параметры красного флуоресцентного белка mRFP1. // Труды конференции «Альманах клинической медицины», издается МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, 2006.

Том ХII, с. 42.

10. Ширшин Е.А., Банишев А.А., Вржещ Е.П. Фотофизические параметры и механизмы флуоресценции белка. // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов2006»,секция “Физика”, Москва, Россия, апрель 2006, Тезисы докладов, с. 157.

11. Banishev A.A., Shirshin E.A., Fadeev V.V. Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Technical Digest of International Conference on Lasers, Applications and Technologies, Minsk, Belarus, May 28-June 1, p. L06/II-(on CD-ROM).

12. Banishev A.A., Shirshin E.A., Fadeev V.V., Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Proc. of SPIE, International Conference on Lasers, Applications and Technologies, Minsk, Belarus, May 28-June 1, V.6733, p.67331B.

13. Banishev A.A., Shirshin E.A., Fadeev V.V. The investigation and laser control of a new class of biosensors – fluorescent proteins. // Technical Digest of International Conference on Laser Applications in Life Sciences (LALS 2007), Moscow, Russia, June 11-14, 2007, p. TuL03P14 (on CD-ROM).

14. Банишев А.А., Загидуллин В.Э., Пащенко В.З., Ширшин Е.А., Фадеев В.В. Лазерная флуориметрия белков. // Сб. статей «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М.: МАКСПресс, 2007, №14, с.43-61.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»