WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Приведена информация о параметрах флуоресценции этих белков, которая определяется одним триптофановым остатком для САЧ (Trp214) и двумя - для БСА (Trp134 и Trp212). Отмечено, что белок БСА является представителем широкого класса объектов – природных макромолекул, содержащих ЛДА пару флуорофоров (два триптофановых остатка).

В п. 1.2.3 рассмотрены фотохимические процессы, которые возникают в молекулах свободного триптофана и триптофан-содержащих белков при воздействии на них УФ света; описаны механизмы фотоионизации (одно- и двухступенчатой) и фотодеградации, свойственные этим объектам.

В разделе 1.3 представлены сведения об особом классе белков - флуоресцентных белках (ФБ), представители которого обладают следующими отличительными свойствами:

1. в отличие от других известных природных макромолекул данные белки формируют внутренний хромофор (особый участок белковой цепи), без каких бы то ни было вспомогательных кофакторов и ферментов (кроме молекулярного кислорода);

2. полосы поглощения и флуоресценции хромофора этих белков лежат в видимой области спектра.

Данные белки являются в настоящее время популярными флуоресцентными маркерами для работ in vivo.

В п. 1.3.1 описаны спектральные свойства и трехмерная структура флуоресцентных белков, на примере зеленного (GFP, максимум флуоресценции на 508 нм) и красного (DsRed, максимум флуоресценции на 583 нм) флуоресцентного белка. Указано, что каждая мономерная субъединица молекулы этих белков (молекула белка не являются мономером) содержит ЛДА пару: триптофан в матрице белка и хромофор белка.

В п. 1.3.2 уделено внимание процессу формирования хромофора (созреванию) флуоресцентных белков (на примере белков GFP и DsRed).

Процесс созревания ФБ - это сложный процесс, который проходит в несколько стадий. На некоторых стадиях созревания ФБ образуются промежуточные интермедиаты (формы) белка, способные сохранять свое присутствие и в конечном препарате белка. A priori препарат ФБ представляют собой смесь нескольких неидентичных и как следствие, различающихся спектральными свойствами форм белка, т.е. ансамбль молекул ФБ является совокупностью нескольких неэквивалентных подансамблей молекул, содержащих ЛДА пару.

В п. 1.3.3 даны сведения о спектральных свойствах красного (максимум флуоресценции на 607 нм) ФБ mRFP1, который является улучшенным аналогом (мутантом) белка DsRed, не проявляющим склонности к олигомеризации и тетрамеризации. Отмечено, что в настоящее время ведутся работы по получению ФБ (в том числе и на основе белка mRFP1) с улучшенными свойствами.

Вторая глава посвящена созданию модели, описывающей кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющей рассчитывать флуоресцентный отклик ансамбля локализованных ДА пар при его лазерном возбуждении.

В разделе 2.1 на основе литературных данных приведена необходимая для изложения оригинальных результатов информация о флуоресценции СОС.

Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика СОС для случая двухкомпонентной смеси однофлуорофорных молекул СОС такой, что между компонентами возможен межмолекулярный перенос энергии. Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика в случае слабоконцентрированного однофлуорофорного раствора СОС со спецификой, свойственной водному раствору триптофана. Выписаны системы кинетических уравнений для населенностей энергетических уровней СОС, которые используются в гл. 3.

В разделе 2.2 разрабатывается модель, описывающая флуоресцентный отклик ансамбля ЛДА пар (в предположении, что возбуждение происходит наносекундными импульсами лазерного излучения) с учётом переноса энергии с возбужденного донора на: а) невозбужденный акцептор; б) возбужденный акцептор (синглет-синглетная аннигиляция).

Введем обозначения S0D, S1D – основное и первое возбуждённое синглетные состояния донора, S0A, S1A – синглетные состояния акцептора.

Молекулы СОС, содержащие ЛДА пару, под действием излучения могут находиться в одном из четырех состояний:

Состояние 1 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии S0D и S0A – концентрацию таких молекул будем обозначать n1 n1(t, r) ;

Состояние 2 - донор молекулы находится в состоянии S1D, а ее акцептор в S0A - концентрацию таких молекул будем обозначать n2 n2 (t, r) ;

Состояние 3 - донор молекулы находится в состоянии S0D, а ее акцептор в S1A - концентрацию таких молекул будем обозначать n3 n3 (t, r) ;

Состояние 4 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии S1D и S1A – концентрацию таких молекул будем обозначать n4 n4 (t, r) ;

Определенные таким образом состояния будем называть коллективными состояниями ЛДА пары. Динамика изменения концентраций приведенных выше четырех коллективных состояний ЛДА пары математически описывается следующей системой кинетических уравнений:

n1 n2 n = -F(t, r) (D + A ) n1 + + D A t 3 nn2 n= -F(t, r) A n2 - - KDA n2 + F(t, r) D n1 + A t D n3 n3 n (1) = -F(t, r) D n3 - + F(t, r) A n1 + + KDA n2 + KSS n A 3 D t n4 n4 n = F(t, r) A n2 + F(t, r) D n3 - - - KSS nD A t 3 n1 + n2 + n3 + n4 = n0, где символы D и A относятся к донору и акцептору соответственно; n0 – полная концентрация молекул СОС; D - сечение поглощения донора, A - сечение поглощения акцептора, соответствующие переходу S0S1; KDA – скорость переноса энергии с возбужденного донора на невозбужденный акцептор; KSS - скорость переноса энергии с возбужденного донора на возбужденный акцептор (синглет-синглетная аннигиляция); 3 - время жизни флуорофора в возбужденном состоянии; F(t, r) – плотность потока фотонов возбуждающего излучения в момент времени t в точке с координатой r = {x, y} в плоскости, перпендикулярной направлению падающего излучения (зависимостью параметров от координаты z вдоль направления пучка пренебрегаем, т.е.

используем приближение оптически тонкого слоя).

Описанные четыре возможные коллективные состояния можно проиллюстрировать следующими энергетическими диаграммами, рис. 1а.

а) б) Рис. 1. а) коллективные состояния локализованной донорно-акцепторной пары (без учета синглет-синглетной аннигиляции); б) процесс синглет-синглетной аннигиляция в модели коллективных состояний (переход S2A S1A происходит за времена порядка пикосекунд).

Перенос энергии по механизму синглет-синглетной аннигиляции в предложенной модели четырех коллективных состояний схематически изображен на рис. 1б. Такой процесс возможен в ЛДА парах, которые находятся в состоянии 4. После элементарного акта синглет-синглетной аннигиляции молекула из состояния 4 переходит в состояние 3.

В разделе 2.3 рассматриваются теоретические основы методов нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии СОС при их возбуждении наносекундными лазерными импульсами. Приводятся алгоритмы решения обратных задач кинетической и нелинейной флуориметрии, результатом применения которых является определение молекулярных фотофизических параметров флуорофоров СОС (сечения поглощения, скорости внутри- и межмолекулярного переноса энергии и др.) из кривых насыщения флуоресценции (Ф-1(F)=NRef/NFl, где NRef – реперный сигнал; NFl – сигнал флуоресценции) и кинетических кривых (I(tdel), где I – норм. сигнал флуоресценции; tdel – задержка строба приемника относительно лазерного импульса). Указано, что данные методы позволяют производить диагностику белковых молекул (в том числе содержащих ЛДА пару) в условиях дефицита априорной информации, обязательной в традиционных методах.

Третья глава посвящена экспериментальному определению фотофизических параметров природных макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцепторную пару, методами лазерной флуориметрии. В качестве объектов исследования были выбраны белок бычий сывороточный альбумин и флуоресцентный белок mRFP1. Каждая молекула этих белков содержит ЛДА пару, причем ансамбль последнего представляет собой смесь нескольких неидентичных подансамблей молекул, содержащих ЛДА пару. Предварительно методы лазерной флуориметрии были апробированы на однофлуорофорных природных соединениях: триптофане в водном растворе и белке сывороточный альбумин человека.

В разделе 3.1 описывается универсальный лазерный флуориметр/ флуорометр (п. 3.1.1), позволяющий реализовывать нелинейную и кинетическую флуориметрию. В отдельных пунктах описаны основные блоки и элементы установки: система лазерного возбуждения на основе импульсного ИАГ:Nd лазера (1.06 мкм, частота следования импульсов 10 Гц) с набором нелинейных кристаллов для получения гармоник основного излучения (532, 355 и 266 нм); система регистрации, на основе стробируемого многоканального анализатора спектра с УФ CCD камерой (длительность строба – 10 нс, шаг перемещения – 2.5 нс). Приведены основные характеристики лазерного излучения, показано, что распределения излучения в поперечном сечении пучка и во времени хорошо аппроксимируются гауссовыми распределениями.

Описана (п. 3.1.2) дополнительная аппаратура, которая использовалась в работе: пикосекундный лазерный флуорометр, спектрофотометр и спектрофлуориметр.

Раздел 3.2 посвящен определению фотофизических параметров молекул триптофана в слабоконцентрированном водном растворе при возбуждении импульсами лазерного излучения с длиной волны 266 нм.

В п. 3.2.1 измеряются и анализируются спектры поглощения и флуоресценции триптофана, делается вывод о необходимости учета двухступенчатых процессов при обработке кинетических кривых и кривых насыщения.

В п. 3.2.2 измеряются и анализируются кривые насыщения и кинетики раствора триптофана, из которых (решением обратной задачи по модели, представленной в разделе 2.1) определяются значения фотофизических параметров молекул триптофана:

а) время жизни возбужденного состояния молекулы триптофана (в моноэкспоненциальном приближении, при низком уровне возбуждения) 3=(2.8±1) нс;

б) сечение поглощения молекулы триптофана =(1.6±0.3) 10-17 см2;

в) суммарная скорость интеркомбинационной конверсии и ионизации из первого возбужденного синглетного состояния S1 (K32+K3i)=(6±2)107 с-1, которой соответствует сумма квантовых выходов в триплет и ионизации (T+i)=(0.17±0.05);

г) суммарное сечение обратимого и необратимого фотопревращения при поглощении возбуждающего излучения (266 нм) молекулами в возбужденном состоянии S1 (3i+ph)=(2.2±0.7)10-18 см2.

Таким образом, видно, что совместное применение нелинейной и кинетической флуориметрии позволяет производить диагностику сложных органических соединений, фотофизические процессы в которых описываются значительным числом (в данном случае четырьмя) параметров.

Раздел 3.3 посвящен определению фотофизических параметров триптофан-содержащих белков, таких как сывороточный альбумин человека и бычий сывороточный альбумин в водном растворе, методами лазерной флуориметрии. Последний является представителем широкого класса объектов – макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцепторную пару.

В п. 3.3.1 производится измерение и анализ спектров поглощения и флуоресценции этих белков. Из анализа спектров поглощения делается вывод о том, что в общем случае, не корректно сечению поглощения триптофанового остатка в белке приписывать значение сечения поглощения свободного триптофана в растворе, считая, что этот параметр является консервативным и слабо зависит от его окружения. Из анализа спектров флуоресценции делается вывод, что в БСА два флуорофора (триптофаны Trp134 и Trp212) находятся в разном локальном окружении.

В п. 3.3.2, на основе материала, изложенного в п. 3.3.1 и литературном обзоре, делается вывод, что в ЛДА паре белка БСА донором энергии является Trp212, а акцептором Trp134. Далее, измеряются и анализируются кинетические кривые и кривые насыщения флуоресценции белков САЧ и БСА, из которых путем решения обратной задачи нелинейной и кинетической флуориметрии определяются фотофизические параметры флуорофора САЧ и флуорофоров БСА. При обработке экспериментальных кривых использовалась трехуровневая модель формирования флуоресцентного отклика, представленная в разделе 2.1 (для САЧ), и модель коллективных состояний (1) (для БСА). При проведении экспериментов с белком БСА регистрация флуоресценции производилась на длинах волн 310 нм (при построении кинетических кривых и кривых насыщения флуоресценции донора) и 390 нм (при построении аналогичных кривых для акцептора). Измеренные кривые насыщения и кинетики для белка БСА представлены на рис. 2. Определенные значения фотофизических параметров флуорофоров белков приведены в таблице 1.

Рис. 2. Кривые насыщения (слева) и кинетические кривые (справа) для белка БСА; квадраты – длина волны регистрации 390 нм, круги – 310 нм; линии – теоретические кривые, построенные по модели (1) для параметров, приведенных в таблице 1.

Таблица 1. Фотофизические параметры флуорофоров белков БСА и САЧ.

Белок Параметры* TrpСАЧ 3, нс 4.5±, 10-17 см2 1.3±0.K32, с-1 <10- Trp134 TrpБСА 3, нс 6.2±1 5±, 10-17 см2 3±0.4 1±0.KDA, с-1 <10-KSS, с-1 <10-* в таблице:

- - время жизни возбужденного состояния флуорофора;

- - сечение поглощения флуорофора;

- KDA и KSS – скорость переноса энергии с возбужденного донора (Trp212) на невозбужденный и возбужденный акцептор (Trp134), соответственно.

В раздел 3.4 описан основанный на лазерной флуориметрии (совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии) комплексный метод определения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров подансамблей ЛДА пар флуоресцентных белков. Для белка mRFP1 как представителя природных объектов с ЛДА парами установлена схема фотофизических процессов и определены: доля молекул каждого подансамбля ЛДА пар в конечном препарате белка, фотофизические параметры ЛДА пар.

В п. 3.4.1 измеряются и анализируются спектры поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции ансамбля молекул флуоресцентного белка mRFP1. Показано, что возбуждение раствора белка mRFP1 УФ светом (270 нм) приводит к появлению не только флуоресценции в УФ области (максимум 330 нм), которая соответствует флуоресценции триптофана белковой матрицы, но и флуоресценции в видимом диапазоне (максимум 607 нм). Таким образом, молекула белка mRFP1 представляет собой объект с ЛДА парой, донором возбуждения в которой является триптофан матрицы белка, а акцептором – хромофор белка, причем данные стационарной спектроскопии свидетельствуют о наличии эффективного переноса энергии внутри ЛДА пар.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»