WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

На рисунке 7а представлены кривые плавления PseФДГ GAV с различными скоростями прогрева. Полученные данные говорят о том, что при увеличении скорости прогрева, происходит увеличение температуры теплового перехода Tm.

Такой характер зависимости указывает на то, что тепловая денатурация этого фермента является кинетически контролируемым процессом. Тем не менее, значения энтальпии теплового перехода, полученные при нормировке кривых - 14 o p C, кДж / моль* C Поглощение теплоты, мкВт o p C, кДж / моль* C Поглощение теплоты, мкВт плавления (рис. 7б), также как и в предыдущем эксперименте, не изменяются в зависимости от скорости прогрева.

Пики тепловых переходов характеризуются высокой симметричностью и малой полушириной, что свидетельствует о том, что процесс тепловой денатурации является высококооперативным и на промежуточных стадиях не происходит диссоциации молекулы фермента на отдельные субъединицы.

Следующим этапом работы было изучение влияния на характер кривых плавления ФДГ кофермента NAD+ и ингибитора азид-иона N3, который является аналогом формиата. Оказалось, что присутствие в растворе различных концентраций NAD+ приводит лишь к незначительному увеличению стабильности фермента, при этом максимальное увеличение температуры теплового перехода составляет всего 2 °C, а величина энтальпии термоденатурации остается практически постоянной (рис. 8а). В то же время при образовании тройного - комплекса [ФДГ+NAD++N3 ] в присутствии различных концентраций NAD+ и Nнаблюдается значительное повышение термостабильности ФДГ: температура плавления увеличивается на 6 °C, а теплота – на 25% (рис. 8б).

(4) (5) (1) (3) (2) (3) (2) (4) 200 (1) а) 100 б) --55 60 65 70 75 55 60 65 70 75 T, oC T, oC Рис. 8. а) Кривые плавления PseФДГ GAV при различных концентрациях NAD+:

(1) свободный фермент, (2) 1,5 мкМ, (3) 4,5 мкМ, (4) 13,5 мкМ; б) Кривые плавления PseФДГGAV в присутствии NAD+ и -N3 : (1) свободный фермент, (2) 4,5 мкМ NAD+ и 60 мМ - N3, (3) 1,5 мкМ NAD+ и 180 мМ N3, (4) 4,5 мкМ NAD+ и 180 мМ N3, (5) 13,5 мкМ NAD+ и 540 мМ N3 (скорость прогрева 1°C/мин, Cферм 1мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о значительных конформационных изменениях, приводящих к стабилизации фермента, при образовании таких комплексов. Это хорошо согласуется с результатами, полученными при анализе кристаллической структуры апо- и холоформ PseФДГ, который показал, что при переходе молекулы фермента в тройной комплекс происходит компактизация белковой глобулы, что и приводит к увеличению стабильности.

- 15 o o p p C, кДж / моль* C C, кДж / моль* C Увеличение компактности молекулы (4) (5) фермента также может происходить при увеличении ионной силы раствора, за (3) счет усиления гидрофобных взаимодействий внутри глобулы. Изучение характера кривых плавления в зависимости (2) от концентрации фосфатного буфера показало, что увеличение концентрации (1) фосфат-иона от 0,1 М до 1,0 М приводит к 0 росту температуры теплового перехода PseФДГ GAV на 5 °C, однако теплота -55 60 65 70 75 плавления при этом практически не T, oC Рис. 9. Кривые плавления PseФДГ GAV при меняется (остается постоянной) (рис. 9).

различных концентрациях фосфатного Т.е. в растворах с высокой ионной силой буфера: (1) 0,1 М, (2) 0,22 М, (3) 0,32 М, происходит стабилизация ФДГ, что (4) 0,52 М, (5) 1,0 М (скорость прогрева 1°C/мин, Cферм 1 мг/мл, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) согласуется с данными, полученными при изучении кинетики инактивации PseФДГ GAV в аналогичных условиях.

На рисунке 10 приведены кривые плавления всех исследуемых ФДГ в апоформе в стандартных условиях. Рассчитанные параметры тепловых переходов представлены в таблице 5. Из этой таблицы видно, что наиболее стабильны бактериальные ФДГ из Pseudomonas sp.101 и ее мутантные термостабильные формы. Далее по уменьшению термостабильности довольно плотно располагаются ферменты из (3) (1) (2) (5) (7) (6) (4) (8) -35 40 45 50 55 60 65 70 75 80o T, C Рис. 10. Кривые плавления ФДГ из различных источников: (1) Pseudomonas sp.(дикий тип), (2) Pseudomonas sp.101 (GAV), (3) Pseudomonas sp.101 (T7), (4) Moraxella sp.C-1, (5) Candida boidinii, (6) Saccharomyces cerevisiae, (7) Arabidopsis thaliana, (8) Glycine max (скорость прогрева 1°C/мин, Cферм 1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) - 16 o p C, кДж / моль* C o p C, кДж / моль* C A.thaliana, Moraxella sp.C-1 и C.boidinii. И наименее стабильными оказались ФДГ из сои G.max и пекарских дрожжей S.cerevisiae.

Таблица 5.

Параметры тепловых переходов ФДГ из различных источников (скорость прогрева 1°C/мин, Cферм 1мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) Источник ФДГ Hпл*, кДж/моль Tm**, °C T1/2, °C Pseudomonas sp.101 2060 67,6 5,Pseudomonas sp.101 (GAV) 1980 68,8 5,Pseudomonas sp.101 (T7) 2330 74,0 5,Moraxella sp.C-1 1830 63,4 4,Candida boidinii 1730 64,4 5,Saccharomyces cerevisiae 820 46,4 3,Arabidopsis thaliana 1330 64,9 5,Glycine max 820 57,1 7,* - относительная погрешность при расчете Hпл – 5-8% ** - абсолютная погрешность при измерении Tm – 0,2 °С Исключением из общей закономерности по механизму тепловой денатурации оказалась SceФДГ. Согласно данным кинетических экспериментов (Серов А.Е., 2002) термоинактивация этого фермента происходит в две стадии, одна из которых обратима, а вторая необратима. Предполагаемый механизм этого процесса приведен на следующей схеме:

43, °C, NA 7ND 46,4D °C где NA – активный фермент, ND – частично обратимо инактивированный фермент, D – необратимо инактивированный фермент. При рассмотрении кривой плавления SceФДГ в стандартных условиях (рис. 11а), можно заметить, что пик теплового перехода несимметричен и в области 41-44 °C наблюдается плечо, которое возможно и соответствует стадии обратимой денатурации. Для проверки этой гипотезы был проведен эксперимент, в котором образец SceФДГ прогревали до 44 °C, а затем, после охлаждения, проводили отжиг в полном диапазоне температур.

При сравнении со стандартной кривой плавления, полученной в тех же условиях для другого препарата этого фермента, видно, что обе кривые совпадают с погрешностью, допустимой для данного эксперимента. Таким образом, можно утверждать, что тепловая денатурация ФДГ из пекарских дрожжей происходит по двухстадийному механизму, в котором первая стадия является обратимой, а вторая – необратимой.

- 17 62.0oC (6) (2) Tm 46,4oC 200 400 б) а) 58.8oC (5) 150 47.1oC (2) (1) 46.4oC (1) 100 200 (4) 56.8oC 150 46.6oC (3) 44oC -35 40 45 50 35 40 45 50 55 60 T, oC T, oC Рис. 11. а) Кривые плавления SceФДГ: (1) стандартный прогрев, (2) второй прогрев после отжига до 44 °С и охлаждения (скорость прогрева 1 °C/мин, Cферм 1мг/мл, 0,05 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0); б) Кривые плавления SceФДГ при различных концентрациях NAD+ и - N3 : (1) свободный фермент, (2) 4,5мкМ NAD+, (3) 0,75мкМ NAD+ и 10мМ N3, (4) 2,25мкМ - - NAD+ и 30мМ N3, (5) 4,5 мкМ NAD+ и 60мМ N3, (6) 11,25 мкМ NAD+ и 210мМ N3 (скорость прогрева 1 °C/мин, Cферм 1мг/мл, 0,05 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) Также интересные результаты были получены при изучении влияния NAD+ и азида на стабильность SceФДГ. Оказалось, что их добавление приводит к очень сильной стабилизации фермента, гораздо большей, чем наблюдалась в предыдущих случаях (рис. 11б). Из рисунка хорошо видно, что при увеличении концентрации NAD+ и N3 фермент из апо-формы переходит в двойной, а затем и в тройной комплекс. При образовании тройного комплекса наблюдается увеличение температуры теплового перехода на 16 °С. Величина же энтальпии процесса термоденатурации увеличивается почти в два раза. Полученные данные свидетельствуют о гораздо более значительных конформационных изменениях, чем у бактериальных и растительных ферментов, происходящих при связывании ФДГ из S.cerevisiae в тройной комплекс.

Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью спектроскопии кругового дихроизма С целью проверки данных, полученных с помощью изучения кинетики инактивации и с применением ДСК, а также для получения дополнительной информации о механизме процесса термоденатурации, исследуемые формиатдегидрогеназы были охарактеризованы с помощью спектров кругового дихроизма (КД). Для всех исследуемых ФДГ были сняты при комнатной температуре спектры КД в диапазоне от 200 до 250 нм (рис. 12). За денатурацией ферментов при повышении температуры следили на длине волны 222 нм, которая является одним из характеристических максимумов интенсивности сигнала КД для -спирали.

- 18 o o p C, кДж / моль* C p C, кДж / моль* C (4) (6) (5) -(1) 222нм (2) (3) -200 210 220 230 240 Длина волны, нм Рис. 12. Спектры КД для ФДГ из: (1) Pseudomonas sp.101, (2) Moraxella sp.C-1, (3) C.boidinii, (4) S.cerevisiae, (5) A.thaliana, (6) G.max (Cферм 0,1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) Форма спектров КД, полученных для ФДГ, является типичной для большинства белков, имеющих в структуре молекулы значительную долю -спиралей. Это подтверждается данными рентгеноструктурного анализа формиатдегидрогеназ (PseФДГ, CboФДГ, MorФДГ, AraФДГ), согласно которым доля -спиралей в структуре ферментов составляет 28-34%. Также отметим присутствие в спектрах КД минимумов в районе 215-216 нм, что указывает на наличие в белковой глобуле -структур. Из значения молярной эллиптичности на длине волны 222 нм по методу, предложенному Ченом и др., были рассчитаны доли альфа-спиральности для всех исследуемых ферментов (табл. 6). Для сравнения в таблице приведены аналогичные величины, полученные с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА).

Таблица 6.

Доля -спиралей в структуре ФДГ из различных источников КД РСА Источник ФДГ, %, % Pseudomonas sp.101 31 Moraxella sp.C-1 28 Candida boidinii 34 Saccharomyces cerevisiae 33 н/д Arabidopsis thaliana 30 Glycine max 32 н/д * - относительная погрешность при расчете доли -спиралей – 5% Из данных таблицы 6 видно, что значения, полученные с использованием двух методов, демонстрируют высокую корреляцию. При этом следует отметить, что доля - 19 Молярная эллиптичность, град*см /дмоль -спиралей в структуре исследуемых формиатдегидрогеназ приблизительно одинакова.

На рисунке 13а приведены температурные зависимости интенсивности сигнала КД при длине волны 222 нм для исследуемых ФДГ. Каждый препарат фермента подвергался первичному прогреву, а затем после охлаждения, прогревался второй раз. Для всех ферментов спектр повторного плавления не отображал каких-либо изменений эллиптичности, что подтверждает необратимость процесса тепловой денатурации ФДГ. Условия экспериментов были подобраны такие же, как в случае ДСК – скорость прогрева 1 °C/мин, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, pH 7,0. Использовались препараты ферментов с концентрацией ~0,1 мг/мл.

(5) 4 (3) (2) (4) (4) (6) (1) (3) -(1) -(6) -(2) -(5) -----35 40 45 50 55 60 65 70 75 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 T, oC T, oC Рис. 13. а) Температурные зависимости интенсивности сигнала КД при длине волны 222 нм для ФДГ из: (1) Pseudomonas sp.101, (2) Moraxella sp.C-1, (3) C.boidinii, (4) S.cerevisiae, (5) A.thaliana, (6) G.max (скорость прогрева 1 °C/мин, Cферм 0,1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0); б) Дифференцированные температурные зависимости интенсивности сигнала КД при длине волны 222 нм для ФДГ из: (1) Pseudomonas sp.101, (2) Moraxella sp.C-1, (3) C.boidinii, (4) S.cerevisiae, (5) A.thaliana, (6) G.max Характер зависимостей для всех исследуемых ферментов, кроме SceФДГ, оказался схожим. Для большей наглядности эти зависимости были продифференцированы (рис. 13б). Пики тепловых переходов, также как и в случае экспериментов с применением ДСК, являлись высокосимметричными и характеризовались малой полушириной. Рассчитанные характеристики тепловых переходов (табл. 7) хорошо согласуются с аналогичными данными из ДСК.

Температурные зависимости интенсивности сигнала КД показывают динамику изменения состояния -спиралей в структуре фермента, в то время как кривые плавления ДСК отображают характер плавления всей белковой глобулы. Таким образом, из вышесказанного можно сделать вывод о том, что тепловая денатурация ФДГ является высококооперативным процессом, в котором происходит одновременное разрушение всех элементов структуры фермента.

- 20 КД, мград Первая производная Таблица 7.

Характеристики тепловых переходов, полученные с помощью ДСК и из спектров КД ДСК КД Источник ФДГ Tm, °C T1/2, °C Tm, °C T1/2, °C Pseudomonas sp.101 67,6 5,4 67,8 5,Pseudomonas sp.101 (GAV) 68,8 5,6 69,0 6,Pseudomonas sp.101 (T7) 74,0 5,5 74,1 5,Moraxella sp.C-1 63,4 4,9 62,4 5,Candida boidinii 64,4 5,3 65,1 4,Saccharomyces cerevisiae 46,4 3,2 48,1 2,Arabidopsis thaliana 64,9 5,9 65,0 7,Glycine max 57,1 7,5 57,5 7,Для проверки гипотезы о наличии в механизме термоденатурации SceФДГ обратимой стадии был проведен эксперимент, аналогичный описанному в прошлом разделе, с отжигом препарата фермента до 44 °C и повторным прогревом после охлаждения (на рисунке не показано). Также как и в случае ДСК, кривая повторного плавления совпала с таковой для другого препарата этого фермента в аналогичных условиях, что доказывает наличие обратимой стадии в процессе тепловой денатурации SceФДГ.

Исследование структуры формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью РСА Последним этапом работы было получение препаративных количеств исследуемых ферментов для дальнейшей кристаллизации и анализа полученных структур. Кристаллизация препаратов ферментов и решение полученных структур проводились в группе под руководством К.М. Полякова. В таблице 8 приведены все полученные кристаллические формы ФДГ.

Можно выделить следующие наиболее интересные результаты, полученные в этой части работы:

1. Оказалось, что лучше всех кристаллизуется рекомбинантная ФДГ из бактерий Moraxella sp.C-1. Именно для нее были получены кристаллы с высоким разрешением до 1,1 ангстрема. В структурах ФДГ из Moraxella sp.C-1 были локализованы все 400 аминокислотных остатков, в то время как в случае апо- и холо-форм PseФДГ видны только 373 и 390 остатков из 400 соответственно;

2. Амидные группы никотинамидной части NAD+ в тройных комплексах - [PseФДГ+NAD++N3 ] и [MorФДГ+NAD++N3 ] развернуты на 180о по отношению друг к другу;

- 21 3. В одной из структур PseФДГ было показано, что атом серы остатка Cys384, (консервативного для всех ФДГ) находится в виде - SO или - SO3, т.е. со временем этот остаток окисляется, с чем, по-видимому, и связано образование различных изоформ фермента при длительном хранении в растворе;

4. Впервые получены кристаллы растительной AraФДГ. Данные для тройного комплекса [AraФДГ+NAD++N3 ] свидетельствуют о возможном образовании не только димерных, но и других олигомерных форм более сложного состава.

Таблица 8.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»