WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Изучение кинетических свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max В таблице 1 приведены кинетические параметры выделенных нами растительных ферментов в сравнении с бактериальной PseФДГ. Из полученных данных можно сделать несколько выводов: 1) рН среды в диапазоне 6,0 – 8,0 не влияет на значения Кm ферментов по обоим субстратам для GlyФДГ и PseФДГ. В случае AraФДГ зависимость Km по обоим субстратам имеет небольшой минимум при рН 7,0. Ферментативная активность в данном диапазоне pH также практически не изменяется; 2) AraФДГ при рН 7,0 близка по своим кинетическим характеристикам к PseФДГ: значения Km по NAD+ у этих ферментов совпадают (65 мкМ), а Km по формиату (3,7 мМ) меньше в 2 раза для фермента из A.thaliana; 3) из сравнения данных, полученных для фермента из G.max cо значениями кинетических параметров AraФДГ и PseФДГ, следует, что GlyФДГ имеет гораздо более низкие значения Кm по коферменту и формиату: значения по NAD+ – 17,4 мкМ и по формиату – 1,26 мМ, что меньше в 4 и 6 раз аналогичных значений для PseФДГ.

Такие низкие значения Km GlyФДГ по обоим субстратам, и особенно по NAD+, делают этот фермент весьма перспективным для регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. В настоящий момент практическому применению GlyФДГ препятствуют ее более низкая удельная активность по сравнению с PseФДГ и низкая стабильность (см. ниже).

- 7 Таблица 1.

Кинетические свойства рекомбинантных формиатдегидрогеназ из бактерий Pseudomonas sp.101 и растений A.thaliana и сои Glycine max при различных pH (0,1 М НФБ, рН 7,0, 30 °С) Параметр pH 6,0 pH 7,0 pH 8,ФДГ из Glycine max Уд. активность, Ед/мг 6,4 ± 0,3 6,2 ± 0,3 6,1 ± 0,КmNAD+, мкМ 15,4 ± 0,7 17,4 ± 1,6 18,8 ± 0,КmHCOO-, мМ 1,37 ± 0,07 1,26 ± 0,10 1,57 ± 0,ФДГ из Arabidopsis thaliana Уд. активность, Ед/мг 6,8 ± 0,3 6,5 ± 0,3 7,8 ± 0,КmNAD+, мкМ 95 ± 6 65 ± 3 81 ± КmHCOO-, мМ 4,2 ± 0,2 3,7 ± 0,2 4,5 ± 0,ФДГ из Pseudomonas sp.Уд. активность, Ед/мг 10,3±0,9 10,0±0,7 9,8±0,КmNAD+, мкМ 68 ± 3 65 ± 2 72 ± КmHCOO-, мМ 6,3 ± 0,2 8,0 ± 0,4 9,1 ± 0,Таблица 2.

Коферментная специфичность формиатдегидрогеназ из бактерий Pseudomonas sp.101 и растений A.thaliana и сои Glycine max (0,1 М НФБ, рН 7,0, 30 °С) NADP+ NAD+ + + Удельная Удельная kcat kcat KmNAD, KmNADP, Фермент активность с активность с NADP+ NAD+ мкМ мМ Km Km NAD+, Ед/мг NADP+, Ед/мг PseФДГ 10,0 ± 0,7 60 ± 5 н/д >200 4,210-AraФДГ 6,5 ± 0,3 65 ± 3 0,05 ± 0,002 10 ± 2 5,010-GlyФДГ 6,2 ± 0,3 17,4 ±1,6 0,31 ± 0,02 1,00 ± 0,05 8,710-В таблице 2 представлены данные по коферментной специфичности бактериальной и растительных ФДГ. Все три фермента гораздо более эффективно (как минимум в 1000 раз) катализируют реакцию с участием NAD+ по сравнению с NADP+. Из таблицы 2 также видно, что эффективность GlyФДГ с NADP+ существенно выше, чем таковая у PseФДГ и тем более у AraФДГ. Например, константа Михаэлиса по NADP+ у GlyФДГ более, чем в 200 раз меньше, чем у PseФДГ. Такие кинетические свойства GlyФДГ позволяют предположить, что при изменении коферментной специфичности этого фермента с NAD+ на NADP+ удастся получить биокатализатор с гораздо с более высокими кинетическими параметрами, чем в случае PseФДГ.

Зависимость активности фермента от температуры описывается уравнением теории активированного комплекса (см. ниже), что свидетельствует о том, что в диапазоне температур 16 – 46 °С в кинетическом механизме не происходит смены лимитирующей стадии. Величины H для AraФДГ и GlyФДГ составили (54,5 ± 0,6) и (43,2 ± 0,6) кДж/моль соответственно, что меньше таковой для PseФДГ (59,8 ± 0,5).

- 8 Это означает, что наибольшее увеличение активности при росте температуры наблюдается в случае PseФДГ, а наименьшее – GlyФДГ.

Изучение кинетики термоинактивации формиатдегидрогеназ из различных источников Термостабильность фермента является одним из важнейших параметров, определяющих возможность его практического применения. В литературе имеется большое количество способов представления данных о стабильности, но наиболее объективным является исследование кинетики термоинактивации, поскольку только такие данные позволяют точно прогнозировать стабильность фермента через любой промежуток времени. Вторым важным моментом при исследовании термостабильности является проведение таких экспериментов в широком диапазоне условий (рН среды, состав среды, присутствие субстратов и продуктов реакции). До проведения настоящих исследований такие систематические исследования были выполнены только для PseФДГ. В данной работе была подробно изучена кинетика термоинактивации еще трех ферментов: AraФДГ, GlyФДГ и CboФДГ. Все эксперименты проводились однотипно. Поэтому мы их продемонстрируем на примере AraФДГ.

3,(1) 2,(2) (1) (3) 2,-1,(4) -(2) 1,(3) -(5) (4) 0,а) б) -0,(5) 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 250 t, мин t, мин Рис. 2. а) Зависимость остаточной активности AraФДГ от времени: (1) 53°С, (2) 55°С, (3) 57°С, (4) 59°С, (5) 61°С (0,1 М НФБ, рН 7,0); б) Зависимость натурального логарифма остаточной активности AraФДГ от времени: (1) 53°С, (2) 55°С, (3) 57°С, (4) 59°С, (5) 61°С Зависимости остаточной активности AraФДГ от времени при температурах 51– 61 °С представляют собой экспоненты (рис. 2а), которые линеаризуются в полулогарифмических координатах (рис. 2б), причем тангенс угла наклона прямых (т.е.

величина константы скорости инактивации первого порядка) не зависит от концентрации фермента. Полученные данные свидетельствуют, что инактивация AraФДГ является необратимым мономолекулярным процессом. Для описания такого процесса может быть использовано уравнение теории активированного комплекса:

- 9 ln(V) V, мкМ/мин S H kBT, G kBT R RT ki = exp- = е e h RT h где kB и h – постоянные Больцмана и Планка, соответственно, R – универсальная газовая постоянная. Это уравнение можно привести к линейному виду:

k k S H H i B ln = ln + - = const T h R RT R T Из тангенса угла наклона определяется величина H, а величину S находят из зависимости:

G = H - ТS Таблица 3.

Термодинамические активационные параметры процесса термоинактивации ФДГ из различных источников (0,1 М НФБ, pH 7,0) H#, S#, Источник ФДГ кДж/моль Дж/моль*К Pseudomonas sp.101 (Рожкова А.М., 1999) 540 ± 20 1320 ± Saccharomyces cerevisiae (Серов А.Е., 2002) 420 ± 40 н/д Candida boidinii 480 ± 30 1250 ± Arabidopsis thaliana 490 ± 30 1200 ± Glycine max 310 ± 20 680 ± Данные таблицы 3 свидетельствуют, что термостабильность ферментов коррелирует с величинами активационных параметров – чем выше их значения, тем выше термостабильность.

Следующим этапом нашей работы было изучение влияния на термостабильность AraФДГ и GlyФДГ таких факторов, как ионная сила и pH среды. В 6 (1) а) б) 4 (1) 2 (2) (2) (3) -0,(3) --0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,[фосфат], М [фосфат], М Рис. 3. а) Зависимость константы скорости инактивации (ki) AraФДГ от концентрации фосфатного буфера: (1) pH 6,0, (2) pH 8,0, (3) pH 7,0; б) Зависимость натурального логарифма константы скорости инактивации (ln(ki)) AraФДГ от концентрации фосфатного буфера: (1) pH 6,0, (2) pH 8,0, (3) pH 7,- 10 i -ln( k ) i k, с качестве примера приведем результаты по определению констант скорости инактивации AraФДГ в растворах фосфатного буфера с различной концентрацией при рН 6,0, 7,0 и 8,0. Полученные данные представлены на рисунке 3.

Поскольку при разных значениях pH наблюдается сильное изменение величин ki, для удобства были построены графики этих зависимостей в координатах ln(ki)[фосфат] (рис. 3б).

-11,Анализ зависимостей на рисунке а) -12,0 свидетельствует, что термостабильность фермента сильно зависит от концентра-12,ции буфера и имеет колоколообразный -13,вид. Сначала при увеличении концентра(1) -13,(2) ции буфера константа скорости инакти(3) -14,вации увеличивается. Это может быть связано с разрушением электростатичес-14,ких взаимодействий на поверхности бел2,98 2,99 3,00 3,01 3,02 3,03 3,04 3,05 3,1/T, 10-3*K-ковой глобулы при увеличении ионной -б) силы. Дальнейшее повышение ионной -силы приводит к усилению гидрофобных -взаимодействий и, как следствие, к повы(1) шению термостабильности. Из рисунка -(2) также следует, что стабильности AraФДГ -(3) при рН 7,0 и 8,0 очень близки, в то время -как снижение рН до 6,0 вызывает уве-личение константы скорости термоинак2,98 2,99 3,00 3,01 3,02 3,03 3,1/T, 10-3*K-1 тивации более, чем в 10 раз. В случае GlyФДГ стабильность фермента при рН -в) 6,0 выше, чем, при рН 7,0 (не показано).

-Для более детального исследова-ния механизма инактивации AraФДГ были (1) изучены температурные зависимости -(2) константы скорости инактивации при тех (3) -значениях концентраций фосфатного буфера, когда величина константы скоро-сти инактивации имеет максимальное, 2,985 3,000 3,015 3,030 3,1/T, 10-3*K-промежуточноe и минимальное значение, Рис. 4. Зависимость констант скорости инаккоторые для каждого значения рН были тивации AraФДГ от температуры в координатах ln(ki /T) – 1/T при различных немного разными (рис. 4). Из полученных концентрациях буфера и значениях pH: а) зависимостей были рассчитаны H# и S# pH 6,0 –[фосфат]: (1) 0,3 М, (2) 0,7 М, (3) 1,2 М; б) pH 7,0 – [фосфат]: (1) 0,04 М, для всех значений рН и концентраций (2) 0,4 М, (3) 0,8 М; в) pH 8,0-[фосфат]:

фосфатного буфера (табл. 4).

(1) 0,1 М, (2) 0,4 М, (3) 0,8 М - 11 i ln( k /T) i ln( k /T) i ln( k /T ) Таблица 4.

Значения активационных параметров процесса термоинактивации ФДГ из A.thaliana при различных значениях рН и концентрациях фосфатного буфера H#, S#, pH [фосфат], М кДж/моль Дж/моль*К 0,3 340 ± 50 820 ± 6,0,7 360 ± 20 780 ± 1,2 273 ± 40 840 ± 0,04 490 ± 30 1200 ± 7,0,4 610 ± 30 1500 ± 0,8 660 ± 60 1600 ± 0,1 450 ± 40 1050 ± 8,0,4 490 ± 50 1150 ± 0,8 670 ± 60 1700 ± Данные таблицы 4 подтверждают сложную природу регулирования стабильности белковой глобулы. В зависимости от условий наблюдается разный ход температурных зависимостей константы скорости инактивации и разный характер изменения активационных параметров. Полученные данные также подтверждают необходимость систематического исследования термостабильности фермента для его эффективного применения на практике.

Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии Температурная стабильность ферментов также может быть охарактеризована с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Этот метод позволяет количественно определить термодинамические параметры теплового перехода между нативным и денатурированным состояниями белковой глобулы, а также выявить существование в процессе тепловой денатурации различных промежуточных форм ферментов.

В литературе нет данных по изучению термостабильности формиатдегидрогеназ с применением дифференциальной сканирующей калориметрии. Поэтому, чтобы максимально расширить область исследования, мы выбрали в качестве объектов – ФДГ из различных типов организмов, в которых были обнаружены эти ферменты. С помощью ДСК нами была изучена тепловая денатурация бактериальных PseФДГ и MorФДГ, дрожжевых CboФДГ и SceФДГ, растительных AraФДГ и GlyФДГ. Кроме того, нами также была изучена термоденатурация мутантных PseФДГ GAV и PseФДГ T7, содержащих соответственно три и семь аминокислотных замен и обладающих повышенной термостабильностью по отношению к ферменту дикого типа.

- 12 Рассмотрим на примере PseФДГ GAV общую стратегию по изучению термостабильности с помощью ДСК. Типичный набор экспериментов включал в себя изучение характера кривых плавления ФДГ в зависимости от: 1) концентрации фермента; 2) скорости прогрева; 3) ионной силы раствора; 4) концентрации кофактора NAD+ и ингибитора N3. После первого полного прогрева препарата фермента для контроля обратимости процесса денатурации проводился повторный прогрев образца. Во всех случаях кривая повторного отжига не содержала пика поглощения теплоты, соответствующего фазовому переходу фермента в денатурированное состояние (рис. 5а).

Tm 68,8oC Tm 68,8oC б) а) (1) (1) 65,8oC (3) (2) (2) 40 45 50 55 60 65 70 75 80 45 50 55 60 65 70 75 T, oC T, oC Рис. 5. а) Кривые плавления PseФДГ GAV: (1) первый прогрев; (2) повторный прогрев после охлаждения; б) Кривые плавления PseФДГ GAV: (1) полный прогрев;(2) первый неполный прогрев до 65,8оС; (3) второй полный прогрев после неполного первого (Cферм 1 мг/мл, скорость прогрева 1°C/мин, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) Был проведен дополнительный эксперимент, в котором препарат фермента прогрели до температуры, соответствующей 40% высоты пика теплового перехода, (рис. 5б, кривая 2) и после охлаждения был проведен повторный прогрев (рис. 5б, кривая 3). При сравнении со стандартной кривой плавления, полученной в тех же условиях для другого препарата этого фермента (рис. 5б, кривая 1), видно, что высота и площадь пика после повторного прогрева уменьшились, что соответствует снижению концентрации фермента вследствие денатурации. Эти экспериментальные данные свидетельствуют о том, что тепловая денатурация является необратимой. Такой характер кривых плавления наблюдался для всех исследуемых ферментов, кроме ФДГ из S.cerevisiae.

На рисунке 6а изображены кривые плавления PseФДГ GAV при различных концентрациях этого фермента. Видно, что температура теплового перехода не зависит от концентрации, а при нормировке кривых плавления на концентрацию фермента (рис. 6б), получается, что энтальпия теплового перехода также остается - 13 o o p p C, кДж / моль* C C, кДж / моль* C Tm= 68,8oC Tm= 68,8 oC (1) (7) (2) (6) (3) (4) (5) (5) (4) (6) (7) (3) б) а) (2) (1) 55 60 65 70 75 55 60 65 70 75 T, oC T, oC Рис. 6. Кривые плавления PseФДГ GAV при различных концентрациях фермента: а) ненормализованные: (1) 0,25 мг/мл, (2) 0,5 мг/мл, (3) 1,0 мг/мл, (4) 1,5 мг/мл, (5) 2,0 мг/мл, (6) 2,5 мг/мл, (7) 3,0 мг/мл; б) нормализованные: (1) 0,25 мг/мл, (2) 0,5 мг/мл, (3) 1,0 мг/мл, (4) 1,5 мг/мл, (5) 2,0 мг/мл, (6) 2,5 мг/мл, (7) 3,0 мг/мл (скорость прогрева 1°C/мин, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) б) а) (5) (3) (2) (4) (4) (1) (5) (3) (2) (1) 55 60 65 70 75 50 55 60 65 70 75 T, oC T, oC Рис. 7. Кривые плавления PseФДГ GAV при различных скоростях прогрева: а) ненормализованные: (1) 0,125 град/мин, (2) 0,25 град/мин, (3) 0,5 град/мин, (4) 1,0 град/мин, (5) 2,град/мин; б) нормализованные: (1) 0,125 град/мин, (2) 0,25 град/мин, (3) 0,5 град/мин, (4) 1,0 град/мин, (5) 2,0 град/мин (Cферм 1мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0) постоянной. Такой характер кривых плавления свидетельствует о том, что процесс тепловой денатурации фермента является истинно мономолекулярным.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»