WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

САДЫХОВ Эльчин Гусейнгулу оглы ПОЛУЧЕНИЕ, ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научные руководители:

доктор химических наук, профессор В.О. Попов доктор химических наук, профессор В.И. Тишков

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корреспондент РАН А.Г. Габибов доктор химических наук, профессор А.П. Савицкий

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится «29» мая 2007 г. в «11.00» часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан «28» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы NAD+-зависимые формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2), окисляющие формиат-ион до углекислого газа, представляют собой несколько групп ферментов, отличающихся как по четвертичной структуре, так и по наличию (или отсутствию) простетических групп и кофакторов. Среди большого разнообразия формиатдегидрогеназ наиболее простым по структуре и составу является фермент, состоящий из двух идентичных субъединиц и не содержащий в активном центре ни ионов металлов, ни простетических групп (ФДГ).

Формиатдегидрогеназа данного типа представляет большой интерес с точки зрения фундаментальной науки, поскольку этот фермент принадлежит к большому суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Субстрат ФДГ – формиат-ион является самым простым по структуре среди субстратов для всех ферментов данного суперсемейства, и в механизме действия ФДГ отсутствуют стадии кислотно-основного катализа переноса протона. Сравнение структуры ФДГ со структурами дегидрогеназ из семейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот показало исключительно высокую пространственную гомологию (в среднем около 80-90%) при очень низком значении степени гомологии на уровне аминокислотных последовательностей (менее 30%). Поэтому формиатдегидрогеназа данного типа рассматривается как модельный фермент для выяснения механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ.

Этот фермент широко распространен в метанол-утилизирующих микроорганизмах и играет важную роль в снабжении клетки энергией при окислении метанола до СО2 с помощью полиферментной системы – метанолдегидрогеназа, формальдегиддегидрогеназа и формиатдегидрогеназа. Наиболее изученными у метилотрофных микроорганизмов являются ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.(PseФДГ) и дрожжей Candida boidinii (CboФДГ). Эти ферменты используются в качестве универсального биокатализатора регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. В нашей лаборатории для обоих ферментов были созданы рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие выход до 3-5 граммов целевого продукта с литра среды. Несмотря на получение различных мутантов PseФДГ и CboФДГ с улучшенными свойствами, проблема получения новых мутантов и их физико-химическая характеристика (в первую очередь изучение стабильности и механизма инактивации в различных условиях) является одним из основных условий успешного применения биокатализаторов на практике. До наших исследований в литературе отсутствовали систематические данные по химической, операционной и температурной стабильности ФДГ в зависимости от различных факторов.

Формиатдегидрогеназы также ранее были найдены в семенах фасоли, гороха и сои. Секвенирование геномов различных растений, выполненное в последнее десятилетие, показало, что этот фермент присутствует во всех высших растениях и - 3 мхах. На примере картофеля (а позднее для ячменя и Arabidopsis thaliana), было показано, что ФДГ расположена в митохондриях и является белком стресса. В условиях стрессовых воздействий содержание ФДГ достигает до 9% от общего количества митохондриальных белков! Основным сдерживающим фактором изучения растительных ФДГ был низкий выход фермента, кроме того, его свойства сильно зависели от метода выделения. Несмотря на то, что были получены трансгенные растения A.thaliana, тем не менее, так и не удалось наладить получение ФДГ в больших количествах. Все описанные в литературе попытки экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli были неудачными, поскольку фермент синтезировался в нерастворимой и неактивной форме в виде телец включения.

Получение ФДГ из растений в больших количествах (десятки и сотни миллиграмм) также очень важно для получения кристаллов этих ферментов. К моменту начала нашей работы в банке трехмерных структур белков PDB имелось только две структуры для апо- и холо-форм PseФДГ. Поэтому получение, изучение свойств и определение трехмерной структуры растительных ФДГ является исключительно актуальной научной задачей.

В работе в качестве объектов исследования были использованы рекомбинантные ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseФДГ) и Moraxella sp.C-(MorФДГ), метилотрофных дрожжей C.boidinii (CboФДГ) и пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (SceФДГ) и растений A.thaliana (AraФДГ) и сои Glycine max (GlyФДГ). Гены PseФДГ, CboФДГ и SceФДГ были клонированы в нашей лаборатории, ген MorФДГ был клонирован нами совместно с профессором К. Асано из Университета префектуры Тояма и проф. Н. Есаки из Университета Киото (Япония).

Плазмиды с полноразмерными генами AraФДГ и GlyФДГ (включая сигнальные последовательности для транспорта в митохондрии) были любезно предоставлены проф. Марквелом из Университета штата Небраска (Линкольн, США) и проф.

Н. Лабру из Сельскохозяйственного Университета Афин (Греция) соответственно.

Цель работы Целью данной работы являлось получение рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ и комплексное изучение структуры и термостабильности ФДГ из бактерий (PseФДГ, MorФДГ), дрожжей (CboФДГ, SceФДГ) и растений (AraФДГ, GlyФДГ). Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработка метода экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli с целью получения активных растворимых ферментов в препаративных количествах для дальнейшей кристаллизации и изучения термостабильности;

2) Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных ФДГ;

3) Комплексное изучение термостабильности исследуемых ферментов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), анализа изменения спектров кругового дихроизма (КД), кинетики термоинактивации.

Выявление факторов, влияющих на термостабильность ФДГ;

- 4 4) Наработка больших количеств ферментов для кристаллизации. Анализ полученных трехмерных кристаллических структур.

Научная новизна 1) Впервые произведена успешная экспрессия растительных ФДГ из A.thaliana и G.max в клетках E.coli в активной растворимой форме;

2) Произведено систематическое исследование термостабильности ФДГ из различных источников при разных значениях рН и состава среды с помощью различных подходов: 1) изучение кинетики термоинактивации, 2) исследование спектров кругового дихроизма и 3) анализ кривых плавления с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Все три подхода дали аналогичные результаты. Показано, что термостабильность каждого из 6 изученных ферментов имеет сугубо индивидуальный характер и в зависимости от температуры, рН и состава среды различия в стабильности могут составлять два и более порядков.

3) С использованием высокоэффективной системы экспрессии отлажена методика получения больших количеств ФДГ для последующей кристаллизации.

Получены новые трехмерные кристаллические структуры различных форм ФДГ из Pseudomonas sp.101, Moraxella sp.C-1 и A.thaliana.

Практическая значимость работы 1) Данные, полученные при комплексном изучении термостабильности ФДГ из различных источников, позволяют оптимизировать промышленное применение этих ферментов путем подбора подходящего фермента для использования в конкретных условиях;

2) Более низкие по сравнению с другими ФДГ значения констант Михаэлиса ФДГ из G.max по NAD+ и формиату делают этот фермент очень перспективным для регенерации NAD(P)H в процессах тонкого органического синтеза хиральных соединений.

Апробация работы Результаты работы были представлены на III Moscow International Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects Development», (Moscow, Russian Federation, 2005); Международной конференции «Biocatalysis – 2005: fundamentals and applications» (St. Petersburg, Russian Federation, 2005), Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ-2005» (Москва, 2005), 7th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations (Delft, The Netherlands, 2005).

Публикации По материалам работы опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов.

Структура диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на _ страницах. Список цитируемой литературы включает наименований.

Иллюстративный материал содержит рисунков и _ таблиц.

- 5 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспрессия формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max в клетках E.coli Одной из причин неудач предыдущих экспериментов по экспрессии генов растительных формиатдегидрогеназ могло быть наличие на N-конце сигнального пептида. Эти сигнальные пептиды отщепляются после транспорта ФДГ в митохондрии. Чтобы получить ферменты, имеющие такие же свойства, что и природные, нами в последовательностях генов AraФДГ и GlyФДГ были удалены участки, кодирующие сигнальные пептиды. На рисунке 1 представлены N-концевые участки аминокислотных последовательностей полноразмерных и укороченных генов AraФДГ и GlyФДГ. Для сравнения приведены N-концевые участки полноразмерных последовательностей ФДГ из картофеля (PotFDH) и бактериальной PseФДГ.

PotФДГ............SRVASTAARAITSPSSLVFTRELQASPG-PKKIVGVFYKANEYA AraФДГ.......MAMRQAAKATIRACSSSSSSGYFARRQFNASSGDSKKIVGVFYKANEYA rAraФДГ................................MQFNASSGDSKKIVGVFYKANEYA GlyФДГ.MSDPTLAQQHLVKVHTTTHETVVTTHNHNQTPSINAS-GEKKKIVGVFYKGNEYA rGlyФДГ................................MSINAS-GEKKKIVGVFYKGNEYA PseФДГ.........................................MAKVLCVLYDDPVDG Рис. 1. N-концевые последовательности полноразмерных и укороченных генов AraФДГ и GlyФДГ, ФДГ из картофеля (PotФДГ) и бактерий Pseudomonas sp.101 (PseФДГ). В последовательности PotФДГ курсивом выделен отщепляемый сигнальный пептид Удаление сигнальных последовательностей проводили с помощью полимеразной цепной реакции и специально сконструированных праймеров. При этом в прямой праймер был введен сайт рестрикции NdeI, а в обратный – EcoRI, которые были использованы для клонирования полученных фрагментов ПЦР в вектор pET23a, в котором из полилинкера дополнительно был удален ряд сайтов рестрикции. Эти новые плазмиды для экспрессии AraФДГ и GlyФДГ получили название р1AraFDH и p1GlyFDH. Клонирование генов ФДГ было выполнено в нашей лаборатории к.х.н. А.Е.Серовым, все дальнейшие эксперименты по оптимизации экспрессии и выделению ферментов проводились лично диссертантом. Для экспрессии был выбран штамм E.coli BL21(DE3) CodonPlus. Характерной особенностью этого штамма является дополнительная экспрессия тРНК для редких в прокариотах кодонов AGA, AGG и ССС, которые имеются в обоих генах экспрессируемых эукариотических ФДГ.

Нами была проведена оптимизация условий культивирования обоих штаммов – продуцентов AraФДГ и GlyФДГ (температура, состав среды, время и тип индуктора, аэрация и т.д.). При оптимальных условиях в случае AraФДГ доля целевого фермента от общего количества растворимых белков E.coli составляла 20-25%, а для GlyФДГ – 7-10%. При завершении культивирования активность ферментов составляла 5000 и 1000 Ед/л культуральной среды для AraФДГ и GlyФДГ - 6 соответственно. В пересчете на удельную активность ферментов выход AraФДГ и GlyФДГ составил 850 и 170 мг с литра среды соответственно. Очистку растительных ФДГ проводили по методике, ранее разработанной для фермента из Pseudomonas sp.101. Выход целевого фермента в случае AraФДГ составил 62%, а в случае GlyФДГ – 43%. По данным аналитического электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия чистота образцов ферментов составляла не менее 95%.

Экспрессия формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp.101, Moraxella sp.C-1, Candida boidinii и Saccharomyces cerevisiae в клетках E.coli Для экспрессии формиатдегидрогеназ из других источников (Pseudomonas sp.101, Moraxella sp.C-1, C.boidinii, S.cerevisiae), изученных в этой работе, были использованы созданные ранее в нашей лаборатории генно-инженерные конструкции. Методика экспрессии использовалась та же, что и в случае растительных ФДГ. Единственным отличием являлась температура – более стабильные бактериальные PseФДГ и MorФДГ были экспрессированы при 30 °С, а дрожжевые ферменты CboФДГ, SceФДГ – при 25 °С. Все выделенные препараты ферментов имели чистоту не менее 95%. Выход ферментов по активности после очистки составлял не менее 60%.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»