WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТДФ С апоТК В ПРИСУТСТВИИ Mg2+ В КАЧЕСТВЕ КОФАКТОРА Определение константы диссоциации, Kd, комплекса ТК···ТДФ (схема 1) Если попытаться определить четыре микроскопические константы при математической обработке данных спектрофотометрического титрования, а именно Kd, K1, K2 и, то можно столкнуться 0,с тем, что достоверно определить 4, 0,одновременно все эти параметра из 0,1 экспериментальных данных нельзя. В 0,теоретических уравнениях присутствует 0,произведение двух констант (Kd·), поэтому 0,2 4 6 8 найти каждую из них одновременно не Время, с представляется возможным. Выйти из Рис.3. Кинетика реконструкции холотранскетолазы в присутствии данной ситуации можно, если один из Mg2+ с использованием различных концентраций ТДФ: 0,15; 0,3; 1; 2 и параметров будет известен. В частности, из 3 мМ (соответственно, кривые 1-5).

экспериментальных данных, полученных 25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6; 2,5 мМ MgС12; 6,75 мкМ ТК методом остановленного потока (рис. 3), [1]. На рисунке показаны начальные участки кривых, для которых были можно определить значение константы проведены касательные с целью определения начальной скорости диссоциации первичного комплекса связывания. ТДФ с апоТК.

ТК···ТДФ (Kd на схеме 1).

Для этого, сначала необходимо найти зависимость начальной скорости связывания ТДФ с апоТК от концентрации кофермента. Для определения значений начальных скоростей связывания ТДФ с апотранскетолазой A необходимо для каждого начального участка кривой (для конкретной концентрации ТДФ) построить касательную. Данный участок будет характеризовать значение начальной скорости; это будет значение тангенса угла наклона касательной.

Полученная зависимость начальной 0,скорости связывания (v0) от концентрации ТДФ (рис. 4) описывается простой гиперболической функцией:

0,v0,пред[ТДФ] v0 =, (7) Kd + [ТДФ] 0,где v0,пред предельное значение v0 при 1 2 [ТДФ], мM [ТДФ], а Kd – микроскопическая Рис.4. График зависимости начальной скорости (v0) взаимодействия ТДФ с константа диссоциации комплекса апоТК от концентрации ТДФ. о – рассчитанные значения начальной TK···ТДФ.

скорости для соответствующей Значение v0,пред характеризует концентрации ТДФ, сплошная линия – результат математической обработки с скорость конформационного перехода помощью уравнения (7) для рассчитанных значений v0.

EEL EL.

v0,пред = 2k+1[E]0, (8) где – коэффициент молярной экстинкции комплекса ТДФ с конформационно измененным активным центром (), а k+1 – константа скорости конформационного перехода EEL EL или LEE LE.

В результате математической обработки данных рис.4 мы получили следующие значения параметров v0,пред и Kd: v0,пред = 0,0029 ± 0.0004 А320/сек и Kd = 1,6 ± 0,1 мM.

Определение равновесных констант K1 и KЗначение Kd было использовано нами для анализа функции насыщения ТК тиаминдифосфатом, приведенной на рис. 5 (кривая 1). Для описания зависимости A320 от концентрации кофермента мы использовали уравнения (2) и (4). В выражение для Z входит концентрация свободного ТДФ, [Т], которая связана с общей концентрацией кофермента ([Т]общ) следующим соотношением:

o v, A / сек [Т] = [Т]общ – 2[E]0Y. (9) Увеличение оптической плотности (A320) при титровании апоTK тиаминдифосфатом может быть рассчитано так:

A320 = 2[E]0Z. (10) Для выяснения соответствия Рис. 5. Титрование апотранскетолазы теоретического уравнения тиаминдифосфатом в отсутствие (1) и в присутствии (2) 2,5 мМ экспериментальным данным использовали субстрата-донора, гидроксипирувата (50 мМ глицил-глициновый буфер, программу Scientist (MicroMath, США), в рН 7,6, 2,5 мМ MgCl2, апоТК 0,мг/мл [2]). Точки – результате чего мы получили K1 = 0,0006 ± экспериментальные данные, кривые 0,0002, K2 = 0,0066 ± 0,0007, = 0,00269 ± рассчитаны с помощью уравнений (2), (4), (9) и (10).

0,00002 мкM–1 cм–1.

С учетом полученных значений (K1, K2, Kd, ), мы проанализировали кинетические данные по связыванию ТДФ с транскетолазой, представленные на рис. 6. Сначала, с помощью уравнения (8), мы определили константу скорости k+1. Она оказалась равной 1,33 ± 0,2 с–1. Затем, подставив значения k+и K1 в уравнение k-1 = k+1K1, мы определили константу скорости обратного конформационного перехода: k-1 = 0,0008 ± 0,0001 с–1.

Определение констант скорости конформационного перехода ТК···ТДФ ТК*-ТДФ во втором активном центре ТК.

Для расчета констант скорости прямого и обратного конформационного перехода (соответственно, k+2 и k-2) для второго кофермент-связывающего активного центра фермента мы использовали в соответствии со схемой приводимые ниже кинетические уравнения. Сначала мы разделили все формы фермента на три пула:

P1 = [EE]+[ТEE]+[EEТ]+[ТEE], (11) P2 = [EТ]+[ТE]+[ТEТ]+[ТEТ], (12) P3 = [ТТ]. (13) Сумма всех пулов равна общей концентрации активных центров ТК, [E]0.

Конформационные изменения между пулами описываются следующими дифференциальными уравнениями:

dP = [EET]k-1P2 +[TEET]k-1P2 -[EET]k+1P1 - 2[TEET]k+1P dt dP =-[EET]k-1P2 -[TEET]k-1P2 + [EET]k+1P1 + 2[TEET]k+1P1 -[TEET]k+2P2 + 2k-2P3. (14) dt dP = [TEET]k+2P2 - 2k-2P dt В этих уравнениях [EET], [TEET], [EET], [TE ET] – доли форм фермента в соответствующих пулах:

2Kd[T] [EET] =, (15) Kd + 2Kd[T] +[T][T][TEET] =, (16) Kd + 2Kd[T] +[T]K d [EET] =, (17) Kd +[T] Рис. 6. Кинетика связывания ТДФ транскетолазой при использовании в [T] [TEET] =. (18) качестве кофактора Mg2+ (50 мМ глицинKd +[T] глициновый буфер, pH 7,6, 6,75 мкМ (димер) ТК). Кинетические кривые получены при Принимая во внимание концентрациях ТДФ 150, 300, 1000, 2000 и 3000 мкМ (кривые 1–5, соответственно). На выражения для константы вставке – кинетика связывания ТДФ диссоциации транскетолазой в присутствии 1 мМ гидроксипирувата; [ТДФ] = 150 мкМ [1].

[EET][T] 2[EE][T] [EET][T] Кривые рассчитаны с помощью уравнений Kd = = = (19) [EET] 2[TEET] [TEET] (11)–(20).

и уравнения материального баланса, [EE] + [EET] + [TEET] =1 и [EET] + [TEET] = 1, получаем следующее выражение, характеризующее изменение поглощения во времени:

dA dP2 dP = + 2. (20) dt dt dt Мы использовали уравнения (14) и (20) для анализа кинетических кривых связывания ТДФ с ТК, приведенных на рис. 6. При этом, значение k+2 было рассчитано для каждой кинетической кривой. Математический анализ был осуществлен с помощью программы Scientist. Среднее значение k+2 составило 0,42 ± 0,01 с–1. Теперь, зная K2 и определив k+2, можно рассчитать константу скорости k-2: k-2 = K2k+2 = 0,0028 ± 0,0001 с–1.

Определение констант индивидуальных стадий связывания ТДФ с апоТК в присутствии субстрата-донора Из рис. 5 (кривая 2) видно, что значительная часть начального участка кривой титрования ТК тиаминдифосфатом в присутствии гидроксипирувата представлена прямой линией, что указывает на очень высокое сродство ТДФ к участку связывания кофермента в первом активном центре: весь добавляемый кофермент полностью связывается с апобелком. По этой причине мы не смогли определить значение K1 (а также значение k-1) и во всех последующих расчетах принимали, что константа K1 имеет достаточно низкое значение (10–4). На основании данных, представленных на рис. 5 (кривая 2), использовав уравнения (2), (4), (9), (10) и приняв константу K1 равной 10–4, а константу Kd равной таковой в отсутствие субстрата (1,6 мМ), мы получили = 0,00269 ± 0,мкM–1 см–1 и K2 = 0,008 ± 0,001. Заметим, что те же самые значения и K2 были получены и в том случае, если мы при расчетах использовали значения K1 < 10–4.

При обработке экспериментальных данных, представленных на вставке рис. 6, с помощью уравнений (14)–(20) получены следующие значения кинетических констант скорости конформационных переходов во втором активном центре: k+2 = 0,037 ± 0,005 с–1 и k-2 = 0,00030 ± 0,00004 с–1.

Определение равновесных и кинетических констант индивидуальных стадий связывания ТДФ с апоТК в присутствии Ca2+ Анализ экспериментальных данных по связыванию ТДФ с апотранскетолазой при использовании в качестве кофактора Ca2+ проводили так же, как и в присутствии Mg2+. Данные по кинетике реконструкции холоТК из апоТК и кофермента, полученные методом остановленного потока, приведены на рис. 7а, а на рис. 7б показана построенная на основании данных рис. 7а зависимость начальной скорости взаимодействия ТДФ с апоТК (v0) от концентрации кофермента. В результате анализа этой зависимости с помощью уравнения (7) получили Kd = 340 ± 80 мкМ и v0,пред = 0,0027 ± 0,0002 А320/с.

0,0,0 500 [ТДФ], мкM Рис. 7. Кинетика взаимодействия ТДФ с апотранскетолазой (25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, 2,5 мМ CaCl2, 6,75 мкМ (димер) апоТК). а – кинетические кривые получены при концентрациях ТДФ 75, 150, 300, 445 и 890 мкМ (кривые 1–5, соответственно). На вставке – кинетика связывания ТДФ транскетолазой в присутствии 1 мМ гидроксипирувата;

концентрация ТДФ = 75 мкМ [1]. Сплошные кривые рассчитаны с помощью уравнений (11)– (20). б – зависимость начальной скорости связывания ТДФ с апоТК (v0) от исходной концентрации ТДФ. Точки получены экспериментально, кривая рассчитана с помощью уравнения (7).

Данные спектрофотометрического титрования апоТК тиаминдифосфатом представлены на рис. 8 (кривая 1). Как и в экспериментах с Mg2+ в присутствии субстрата (рис. 5, кривая 2), сродство кофермента к ТК столь велико, что первые порции добавляемого кофермента полностью связываются с первым активным центром фермента и начальный участок кривой – прямая линия.

Поэтому, как и в случае с Mg2+ в присутствии субстрата, определить значение равновесной константы для первого активного центра K1 (а также значение k-1) было невозможно, и мы приняли константу K1 равной 10–4. Значения остальных параметров, определенные с помощью данных, которые приведены на рис. 7 и 8 (кривая 1), таковы: = 0,00375 ± 0,00002 мкМ–1 см–1, K2 = 0,0013 ± 0,(аналогичные значения для этих параметров были получены при значениях K1 < 10–4), k+1 = 0,8 ± 0,1 с–1, k+2 = 0,23 ± 0,05 с-1, k-2 = 0,00029 ± 0,00006 с–1.

o v, A / с Присутствие субстрата-донора при титровании ТК тиаминдифосфатом сопровождается повышением сродства кофермента к апобелку (ср. кривые 1 и на рис. 8). Поэтому ограничения, используемые при определении кинетических характеристик индивидуальных стадий процесса взаимодействия ТДФ с апоТК в отсутствие субстрата, естественно, сохраняются и в данном случае. С этими ограничениями при анализе данных, приведенных на рис. 6 и на вставке рис. 7а, были получены следующие значения исследуемых параметров: = 0,00375 ± 0,00002 мкМ–1 см–1; K2 = 0,00061 ± 0,00004; k+2 = 0,32 ± 0,04 с–1 и k-2 = 0,00019 ± 0,00002 с–1 (значение Kd при расчетах принимали равным полученному в экспериментах без субстрата).

Итак, на первой стадии взаимодействия ТДФ с апоТК (схема 1), когда образуется промежуточный комплекс ТК···ТДФ, значение константы его диссоциации (Kd) определяется типом катиона, используемого в качестве кофактора: в присутствии Mg2+ оно равно 1,6 мМ, а в присутствии Ca2+ – 0,34 мМ (табл. 1).

Рис. 8. Реконструкция холоТК из апоТК и кофермента в отсутствие Однозначно показано, что в субстрата (1) и в присутствии 2,присутствии Mg2+, как и в присутствии Ca2+ мМ гидроксипирувата (2) (50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, существует отрицательная кооперативность 2,5 мМ CaCl2, апоТК 0,67 мг/мл, температура 25°). Точки получены между активными центрами ТК при экспериментально [2], сплошные кривые рассчитаны с помощью связывании ТДФ, причем, во втором случае уравнений (2), (4), (9) и (10).

она выражена в большей степени.

В присутствии субстрата-донора значение равновесной константы изомеризации в первом активном центре (K1 на схеме 2) уменьшается, как минимум, в 6 раз. Значение аналогичной константы во втором активном центре, K2, в присутствии субстрата осталось, по существу, неизменным, в противоположность опытам с Ca2+, где ее значение в присутствии субстрата снижается (табл. 1).

Таблица 1. Значения равновесных и кинетических констант индивидуальных стадий связывания тиаминдифосфата транскетолазой 103, Kd, мкМ- мМ K1 k+1, с-1 k-1, с-1 K2 k+2, с-1 k-2, с-1 см-с Mg2+ в качестве кофактора 1,6 0,0006 1,33 0,0008 0,0066 0,42 0,0028 2,Без субстрата ±0,1 ±0,0002 ±0,2 ±0,0001 ±0,0007 ±0,01 ±0,0001 ±0,В присутствии 1,6 0,008 0,037 0,00030 2,гидрокси- 0,0001 - ±0,1 ±0,001 ±0,005 ±0,00004 ±0,пирувата с Ca2+ в качестве кофактора 0,34 0,0013 0,23 0,00029 3,0,0001 0,8 Без субстрата ±0,08 ±0,0001 ±0,05 ±0,00006 ±0,В присутствии 0,34 0,00061 0,32 0,00019 3,гидрокси- 0,0001 - ±0,08 ±0,00004 ±0,04 ±0,00002 ±0,пирувата ВЫВОДЫ 1. Получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в рамках схемы с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами в димерной молекуле фермента. Для характеристики кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфатсвязывающими центрами предложено использовать зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

2. Зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом использованы для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для различных теоретических моделей димерных аллостерических ферментов.

3. На основании данных спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в равновесных условиях были рассчитаны равновесные константы связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Ca2+ и Mg2+. Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы.

Показано, что как в присутствии ионов Ca2+, так и в присутствии ионов Mg2+ наблюдается отрицательная кооперативность. В случае ионов Ca2+ она выражена более отчетливо.

4. Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику взаимодействия ТДФ с апоТК, и на основании экспериментальных данных, полученных методом остановленного потока, рассчитаны константы скорости прямой и обратной реакций для конформационных переходов, следующих за связыванием ТДФ в каждом активном центре.

5. Показано, что субстрат-донор оказывает влияние на скорость прямого и обратного конформационного перехода неактивного промежуточного комплекса тиаминдифосфат-транскетолаза в каталитически активный комплекс, в котором фермент содержит две связанные молекулы кофермента и один из активных центров претерпел конформационный переход.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 06-04-48395.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»