WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ОСПАНОВ РУСЛАН ВАИТОВИЧ МЕХАНИЗМ СВЯЗЫВАНИЯ ТИАМИНДИФОСФАТА С АПОТРАНСКЕТОЛАЗОЙ 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Г.А.Кочетов доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.Н.Чернов доктор химических наук, профессор А.К.Гладилин

Ведущая организация: Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино апреля

Защита состоится «10» 2007 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Транскетолаза (ТК*, седогептулозо-7-фосфат: Д-глицеральдегид-3фосфатгликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) – ключевой фермент пентозофосфатного пути превращения углеводов. Фермент катализирует перенос остатка гликольальдегида с кетозы (субстрат-донор) на альдозу (субстрат-акцептор) и является простейшим представителем группы тиаминдифосфат-зависимых ферментов. Функцию кофакторов выполняют двухвалентные катионы – Ca2+, Mg2+ и др.

ТК из Saccharomyces cerevisiae, которая является объектом настоящего исследования, достаточно хорошо изучена. Фермент является гомодимером, имеет два структурно эквивалентных активных центра с идентичной каталитической активностью. Проведен рентгеноструктурный анализ ТК, идентифицированы функциональные группы апобелка и кофермента. Показаны существенные различия в свойствах фермента в зависимости от типа катиона, используемого в качестве кофактора. Интенсивно изучается механизм транскетолазной реакции в рамках общей проблемы тиаминового катализа. Что касается кинетического механизма функционирования ТК, механизма ее взаимодействия с ТДФ, характеристики индивидуальных стадий этого процесса, то сведения здесь достаточно ограничены.

Показано, что связывание ТДФ с апоТК происходит в две стадии: первая – быстрая и легко обратимая, приводящая к образованию неактивного промежуточного комплекса фермент-кофермент. Вторая стадия – относительно медленная, связанная с конформационными изменениями активного центра и приводящая к образованию каталитически активного холофермента. В литературе были указания на существование взаимодействий между кофермент-связывающими центрами, однако строгий анализ этих взаимодействий не проводился из-за отсутствия соответствующей теоретической модели. Данные вопросы и предстояло исследовать в диссертационной работе.

*Список сокращений: ТК – транскетолаза, ТДФ –тиаминдифосфат.

Целью настоящей работы является исследование механизма связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Построить теоретическую модель взаимодействия димерного белка с лигандом, с учетом двухстадийного механизма его связывания.

2. Рассчитать значения равновесных и кинетических констант связывания ТДФ с апотранскетолазой.

3. Исследовать влияние субстрата на связывание ТДФ с апотранскетолазой.

4. Исследовать кооперативные взаимодействия между активными центрами транскетолазы.

Научная новизна работы Разработана модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами в димерной молекуле белка. Модель включает стадию конформационного изменения субъединицы, связавшей лиганд. В рамках этой модели получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом.

Проведен теоретический анализ кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для модели Моно, Уаймена, Шанже и Кошланда, Немети, Филмера. Для этой цели разработан новый метод анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами белка с помощью графика зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы.

Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику связывания ТДФ с апоТК. Определены константы скорости для индивидуальных стадий процесса образования каталитически активного холофермента из апо- и кофермента при использовании Ca2+ и Mg2+ в качестве кофактора, в отсутствие и в присутствии субстрата.

Практическая значимость Разработанная модель для белка с взаимодействующими лигандсвязывающими центрами может быть использована для анализа процесса связывания лиганда с любым аллостерическим белком, имеющим два лигандсвязывающих центра.

Предлагаемый новый метод характеристики кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами белка с помощью графика зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения его лигандом может быть использован для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для различных моделей аллостерических ферментов.

Полученные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии, биохимии и ферментативной кинетике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на ХI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), на ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах и состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 91 литературный источник.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ранее было показано (Кочетов, Изотова, 1973), что процесс образования холоТК происходит как минимум в две стадии (схема 1). На первой (быстрой и легко обратимой) стадии происходит Kd k+взаимодействие ТДФ с апоТК, в TK + ТДФ TK...ТДФ TK*-ТДФ результате чего образуется k-промежуточный, легко диссоциирующий Схема 1. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой.

неактивный комплекс ТК···ТДФ. Затем осуществляется изомеризация формы ТК···ТДФ в форму ТК*-ТДФ с образованием достаточно стабильного, каталитически активного холофермента.

Вторая стадия, в отличие от первой, медленная, связанная с конформационными изменениями молекулы белка.

Модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами.

Рассмотрим теперь модель двустадийного связывания лиганда с димерным белком, когда существует взаимодействие между лигандсвязывающими центрами (схема 2). Здесь EE – исходный димер белка, содержащий два лиганд-связывающих центра; L – лиганд; EE и EE – димерные формы белка, содержащие один KEEL Kd конформационно измененный лигандEEL KKd Kd KLEEL связывающий центр (E); EE – димерная LEEL LEEL K1 KEE LEEL Kd Kd форма белка с двумя конформационно LEE Kd Kизмененными лиганд-связывающими LEE центрами; Kd – микроскопическая константа Схема 2. Связывание лиганда с взаимодействующими лиганддиссоциации комплекса белок-лиганд; K1 и связывающими центрами димерного белка.

K2 – равновесные константы конформационного перехода для первого лиганд-связывающего центра, связавшего лиганд, и второго центра, связавшего лиганд после того, как лиганд связался в первом центре, соответственно. Предполагается, что оба лигандсвязывающих центра структурно идентичны и поэтому лиганд может равновероятно связаться как с «левым», так и с «правым» центром димера ЕЕ.

В этом случае образуется либо форма LЕЕ, либо форма ЕЕL (этот переход описывается константой Kd: далее в скобках будет указана константа, характеризующая конкретную стадию), которые между собой неразличимы, кроме положения лиганда. Форма LЕЕ или ЕЕL затем либо связывает второй лиганд с образованием формы LЕЕL (Kd), либо в лиганд-связывающем центре, содержащем лиганд, происходит его конформационное изменение, в результате чего образуется форма LЕЕ, или ЕЕL, соответственно (K1). В форме LЕЕL равновероятно происходит образование форм LЕЕL или LЕЕL (K1), но для форм LЕЕ и ЕЕL образование форм LЕЕL и LЕЕL происходит в соответствии с положением лиганд-связывающего центра, не занятого лигандом (Kd). На последней стадии связывания лиганда происходит завершающее конформационное изменение в том центре, в котором оно еще не произошло, что приводит к образованию формы LЕЕL, соответственно, из форм LЕЕL, или LЕЕL (K2).

Запишем функцию для доли форм белка, связанных с лигандом (Y), через все формы белка, содержащие лиганд:

2[EEL]+ 2[EEL]+ 2([LEEL]+ 2[LEEL]+[LEEL]) Y =. (1) 2[E]Подставив в полученное уравнение (1) выражения для форм белка, получим:

1 [L] 2 1 [L](1+ ) + (1+ + ) K1 Kd K1 K1 K2 Kd Y =. (2) 1 2[L] 2 1 [L]1+ (1+ ) + (1+ + ) K1 Kd K1 K1 K2 Kd Теперь запишем выражение функции для доли конформационно измененных форм белка (Z) так же, как и для (Y), но только через сумму всех конформационно измененных форм белка:

2[EEL]+ 2[LEEL]+[LEEL] Z =, (3) 2[E]Так же как и для уравнения (2) подставляем выражения для форм белка:

[L] 1 [L]+ (1+ ) K1 Kd K2 K1 Kd Z =. (4) 1 2 [L] 2 1 [L]1+ (1+ ) + (1+ + ) K1 Kd K1 K1 K2 Kd При [L] значение Z приближается к предельному значению:

1+ KZпред =. (5) 1+ 2K2 + K1KНормированное значение Z принимает вид 1 [L] (1+ 2K2 + K1K2) [L] + (1+ ) Z K1 Kd K2 K1 Kd Zнорм = =. (6) Zпред 1 2 [L] 2 1 [L] (1+ K2)1+ (1+ ) + (1+ + ) K1 Kd K1 K1 K2 Kd Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом (Y), степени конформационных изменений (Z) и нормированной степени конформационных изменений (Zнорм) от концентрации лиганда L В тех случаях, когда экспериментальные данные позволяют рассчитать степень 1,насыщения белка лигандом и степень 0,конформационных изменений при 0,0,4 различных концентрациях лиганда, может 1,0,быть построен трехмерный график, 0,0,0,0 связывающий величины Zнорм, Y и [L].

Типичный график подобного типа Рис.1. Трехмерный график зависимости степени насыщения Y представлен на рис.1. Из данного графика и нормированной степени можно построить проекцию на плоскость конформационных изменений Zнорм от концентрации свободного Zнорм(Y) и проанализировать эту лиганда [L] (Kd = 800, K1 = 0.01, K2 = 1). График рассчитан по зависимость.

уравнениям (2) и (6).

При K1 << 1 (например, при K1 = 0,01;

рис. 2а) отклонения от прямой, проходящей под углом 45, могут наблюдаться только в случае кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими м р о н Z Y M к м, ] L [ центрами. На графиках зависимости Zнорм от Y подобные отклонения проявляются в виде кривых, располагающихся выше прямой, проходящей под 1,1,1,в а б K1 = 1 K1 = = K1 = 0, = = 1 = 0,5 0,0, = = 0. = = 0, = 0. = 0, = = 0.0,0,0 0,0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,Y Y Y Рис.2. Теоретические зависимости Zнорм от Y при следующих значениях параметра K1: а – K1 = 0,01, б – K1 = 1, в – K1 = 100. Цифры около кривых соответствуют значению параметра ( = K2/K1). Графики рассчитаны по уравнениям (2) и (6).

углом 45°, и выражены тем сильнее, чем больше значение параметра. Эти отклонения соответствуют отрицательной кооперативности.

При значении константы K1 >> 1 (например, при K1 = 100; рис. 2в) отклонения от прямой, проходящей под углом 45, могут наблюдаться только в случае положительной кооперативности взаимодействия между лигандсвязывающими центрами. На графиках Zнорм от Y эти отклонения проявятся в виде кривых, расположенных ниже прямой, проходящей под углом 45°, и выражены тем сильнее, чем меньше значение (рис. 2в).

При K1 = 1 (рис. 2б) отклонения от прямой, проходящей под углом 45, могут быть связаны как с положительными, так и с отрицательными кооперативными взаимодействиями между лиганд-связывающими центрами.

Возможность практического применения разработанной нами модели мы проверили на транскетолазе. В качестве экспериментальных данных использовали результаты спектрофотометрического титрования апотранскетолазы коферментом, тиаминдифосфатом, полученных в отделе биохимии живой клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского Московского Государственного Университета [1, 2]. Сущность метода спектрофотометрического титрования заключается в том, что при взаимодействии ТДФ с ТК в спектре поглощения фермента появляется новая норм норм норм Z Z Z полоса в области 300-340 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов [3-6]. Появление этой полосы характеризует образование каталитически активного холофермента и ее интенсивность строго коррелирует с количеством кофермента, связавшегося с активными центрами транскетолазы.

Специфические изменения спектра при связывании ТДФ и обнаруженные при этом закономерности давали возможность детально исследовать процесс взаимодействия кофермента с апобелком и влияние на него лигандов.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»