WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Alim k1, min-Рис. 10. Графики зависимости А Б 0.предельного кажущегося оптического 0.0.поглощения (Alim) (А) и константы 0.04 скорости 1-го порядка (k1) (Б) от 0.концентрации аргинина при агрегации 0.0.инсулина (0,2 мг/мл).

0.0.0.0.6 1.2 1.0.6 1.2 1.[Arg], мг/мл [Arg], мг/мл Аргинин имеет уникальную положительно заряженную гуанидиновую боковую группу, которая способна связываться с ароматическими аминокислотными остатками. Можно полагать, что в основе образования подобной связи лежат так называемые катион- взаимодействия между аминогруппами аргинина и обобществленным -электроным «облаком» внутри ароматического кольца [Burley, Petsko, 1986; Gallivan, Dougherty, 1999; Ahern et al., 2006].

Ароматические аминокислоты входят в состав как АДГ, так и B-цепи инсулина. Наблюдаемый защитный эффект аргинина связан с электростатическими взаимодействиями аргинина с гидрофобными аминокислотными остатками молекулы субстрата, которые экспонируются наружу в состоянии стресса. Следует отметить также важность гуанидиновой группы, которая принимает участие в увеличении растворимости белков.

Примером может служить гуанидингидрохлорид.

С использованием инсулина в качестве субстрата были исследованы также лизин в концентрациях 10, 20 и 40 мМ. При этом наблюдалось концентрационно-зависимое подавление интенсивности светорассеяния. Лизин в концентрации 40 мМ приводил к полному торможению агрегации. Цитруллин (50 мМ) и гуанидингидрохлорид (20 мМ) не влияли на агрегацию инсулина.

При использовании АДГ в качестве субстрата лизин (20 мМ), цитруллин (мМ) и гуанидингидрохлорид (20 и 250 мМ) не проявляли сколь-нибудь заметного эффекта (данные не приведены).

Большой интерес вызывала также возможность исследования процесса агрегации субстратов в присутствии коротких Arg- и Lys-содержащих амфифильных пептидов.

4. Исследование влияния трипептида (Ala-Phe-Lys) и дипептида (ArgPhe) на термоагрегацию АДГ. С использованием метода ДЛС была изучена o термоагрегация АДГ (0,3 мг/мл) при температуре 42 C в 25 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0, в отсутствие и в присутствии трипептида (Рис. 11).

Интенсивность светорассеяния агрегатов АДГ увеличивается во времени, достигая предельного значения после теплового воздействия в течение 50 мин (Рис. 11A, кривая 1). Трипептид в А концентрации 1 мМ ускоряет термоагрегацию АДГ. При его концентрации 2 мМ наблюдается резкое усиление агрегации в начальный период (до ~3 мин) до величины интенсивности равной 150000 фотоотсчет/с, 10 20 30 сохраняющейся далее на Время, мин постоянном уровне (кривая 3).

800 Б 900 При концентрации 4,5 мМ 3' 300 600 0 прослеживается полное 10 20 30 Время, мин подавление термоагрегации АДГ (кривая 4). При этом не 3' происходит образования 2' преципитатов, что характерно для 1' многих известных шаперонов.

10 20 30 Анализ размеров белковых Время, мин агрегатов (Рис. 11Б) показал В бимодальное распределение их частиц, при котором наблюдаются две популяции: в системе образуются малые (кривые 1’, 2’ и 3’) и большие (кривые 1, 2 и 3) агрегаты. При концентрации трипептида 2 мМ происходит 10 20 30 Время, мин значительный рост величины Rh Рис. 11. Зависимость интенсивности частиц (Рис. 11Б, кривые 3 и 3’), в светорассеяния (А) и значения Rh частиц (Б) то время как интенсивность при агрегации АДГ (0,3 мг/мл) при 42 °С в светорассеяния подавляется (Рис.

мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, от времени в 11А, кривая 3). Вероятно, при отсутствие (1 и 1’) и в присутствии трипептида увеличении концентрации (Ala-Phe-Lys) в концентрациях 1 (2 и 2’), 2 (3 и трипептида в системе количество 3’) и 4,5 мМ (4). Вставка показывает значения Rh в присутствии 1 мМ трипептида. В.

частиц, размеры которых растут в Распределение Rh частиц в присутствии процессе агрегации, уменьшается, трипептида в концентрации 4,5 мМ (4).

достигая минимума при его концентрации 4,5 мМ. При этом наблюдается мономодальное распределение частиц малого размера с Rh ~ нм (Рис. 11В).

Было изучено также действие на кинетику агрегации АДГ другого эффектора – дипептида (Arg-Phe) для того, чтобы провести сравнение между двумя типами катионов. В присутствии дипептида наблюдается картина, аналогичная действию трипептида (данные не показаны). Однако в этом случае добавление дипептида в больших концентрациях (до 35 мМ) не приводит к полному торможению агрегации АДГ, в отличие от действия трипептида, I (фотоотсчет/с) h R ( нм ) h R (нм) h R (нм) Рис. 12. А. Кинетика термоагрегации А360 А АДГ (0,3 мг/мл, зарегистрированная с помощью турбидиметрии при 42 °С в 0.мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и присутствии 0.трипептида в концентрациях 1 (2), 2 (3) и 4,5 мМ (4). Б. Кинетика 0.термоагрегации в отсутствие (1) и присутствии дипептида в концентрациях 0.0.5 (2), 2 (3), 4,5 (4), 7 (5), 12 (6) и 18 мМ 10 20 30 Время, мин (7). Вставка показывает агрегацию в А360 Б Аотсутствие (1) и в присутствии 0.0.дипептида при концентрации 2 мМ 0.0.15 (кривая 3).

0.15 30 0.Время, мин возможно, ввиду структурных 0.особенностей (расположение 0.05 гидрофобных и гидрофильных 0.00 аминокислотных остатков в 10 20 30 молекулах эффекторов, а также Время, мин большая гидрофобность трипептида).

С использованием турбидиметрического метода были получены данные, которые согласуются с результатами ДЛС. Наблюдали аналогичное концентрационно-зависимое действие трипептида и дипептида на термоагрегацию АДГ (Рис. 12A и Б).

5. Исследование влияния синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина на агрегацию модельных белковых субстратов.

Для данной работы были выбраны амфипатические пептиды, характеризующиеся наличием как гидрофобных, так и гидрофильных остатков.

Один из синтетических аналогов грамицидина (G1) отличается от своего прототипа наличием дополнительных 5 положительно заряженных С-концевых аминокислотных остатков. Для определения вклада в функциональную активность гидрофобного участка данной молекулы, был синтезирован другой пептид (G2), в котором удален гидрофобный кластер (Trp-DLeu-Trp-DLeu-TrpAla).

Первичная структура синтетического аналогов грамицидина G1: Ac-Val-Gly-Ala-DLeu-Ala-DVal-Val-DVal-Trp-DLeu-(Trp-DLeu-Trp-DLeuTrp-Ala)-Gly-Ser-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Cys-COOH G2: Ac-Val-Gly-Ala-DLeu-Ala-DVal-Val-DVal-Trp-DLeu-Gly-Ser-Gly-Pro-LysLys-Lys-Arg-Lys-Val-Cys-COOH Исследовали кинетику агрегации модельного белкового субстрата МДГ турбидиметрическим методом при 48 оС в отсутствие и присутствии пептидов G1 и G2 в различных концентрациях (Рис. 13). Показано значительное ускорение агрегации субстрата и увеличение предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм. Причем, G1 в субстехиометрическом диапазоне концентраций усиливает агрегацию субстрата в большей степени по сравнению с G2. При увеличении концентрации G1 значение Аlim возрастает более, чем в два раза (кривая 7).

АРис. 13. А. Кинетика агрегации МДГ А 0.(0,15 мг/мл) при 48 °С в 25 мМ Tris-HCl 0.буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и 6 присутствии пептидов G2 в 0.концентрациях 0,05 (2), 0,1 (3) и 0,0.мг/мл (4) и G1 в концентрациях 9 (5), 0.(6), 100 мкг/мл (7). Б. Кинетика 0.агрегации АДГ (0,15 мг/мл) при 42 °С в 0.25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, в 5 10 15 20 25 30 отсутствие (1) и присутствии пептидов Время, мин G2 в концентрациях 9 (2) и 45 мкг/мл (4) АБ и G1 в концентрациях 3,6 мкг/мл (3) и 0.мкг/мл (5).

0.Изучение кинетики 0.о агрегации АДГ при 42 С в 1 отсутствие и присутствии 0.пептидов G1 и G2 также 0.показывает ускорение агрегации 3 6 9 12 Время, мин при субстехиометрических концентрациях пептидов. В данном случае, подобно экспериментам с использованием МДГ в качестве субстрата, показано, что действие пептида G1 проявляется сильнее, чем G(Рис. 13Б). Для первичного анализа состояния агрегатов после окончания Рис. 14. А. Электрофорез в присутствии ДС-Na в ПААГ растворенных осадков, полученных после агрегации МДГ (0,15 мг/мл) при 48 °С. Дорожки: 1 – в отсутствие пептидов; 2, 3, 4 – в присутствии G2 (0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,2 мг/мл соответственно); 5 – в присутствии G1 (0,мг/мл); 6 – маркеры молекулярных масс (67, 24 и 12 кДа). Б. Нативный электрофорез в ПААГ растворенных осадков после агрегации. Дорожки: 1 – в отсутствие пептидов; 2 – в присутствии G2 (0,2 мг/мл); 3 – в присутствии G1 (0,1 мг/мл); 4 – маркеры молекулярных масс (134 и 67 кДа).

процесса агрегации пробы центрифугировали (10 000g, 20 мин), осадки растворяли в 100 мМ Тris-HCl буфере, pH 7,0, и подвергали их электрофорезу.

Данные электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 14А) показывают, что содержание в осадках МДГ (мономер с молекулярной массой 30 кДа) в присутствии пептидов (дорожки 2–5) существенно возрастает по сравнению с контролем (дорожка 1). Важным результатом проведенных экспериментов является обнаружение гетероагрегатов, содержащих как субстратный белок, так и пептиды, т.е. образуется комплекс субстрат-пептид. По мере усиления агрегации наблюдается увеличение субстратного белка в осадке.

Электрофорез в неденатурирующих условиях (Рис. 14Б) показал, что образуются растворимые агрегаты с молекулярной массой около 120 кДа, что соответствует тетрамеру МДГ.

Анализ электрофореграмм осадков АДГ в нативных и денатурирующих условиях показал наличие растворимых агрегатов (Рис. 15 А и Б). При этом по мере усиления процесса агрегации в присутствии пептида наблюдается увеличение содержания белка в осадке. При электрофорезе в присутствии ДСNa проявляется полоса мономера АДГ с молекулярной массой около 40 кДа.

Так как пептиды использовались в субстехиометрических концентрациях, то их проявления на электорфореграмме не наблюдается.

Рис. 15. Электрофорез в присутствии ДС-Na в 12% ПААГ (А) и нативный электрофорез в 10% ПААГ (Б) растворенных осадков, полученных после агрегации АДГ (0,15 мг/мл) при °С. Дорожки: 1 – в отсутствие пептидов; 2 – в присутствии пептида G2 (45 мкг/мл); 3 – в присутствии пептида G1 (9 мкг/мл); 4 – маркеры молекулярных масс (201, 134, 67 и 24 кДа).

На нативном электрофорезе в ПААГ проб АДГ, полученных после термоагрегации, видно, что растворенные осадки в контроле представлены олигомером с молекулярной массой ~160 кДа (тетрамер АДГ) и агрегатами большого размера, которые едва входят в гель. Однако в присутствии пептидов, наряду с высокомолекулярными агрегатами, мы видим наличие ярко выраженных полос димера и тетрамера АДГ (молекулярные массы 80 и 160 кДа соответственно).

Аналогичные результаты были получены при растворении агрегатов АДГ в присутствии ди- и трипептида (данные не показаны). Результаты свидетельствуют о том, что ускорение агрегации сопровождается появлением агрегатов большого размера, но они при этом оказываются легко растворимыми. Подобное ускорение агрегации наблюдалась также под действием низкомолекулярного (12 кДа) амфифильного белка – фактора ингибирования миграции макрофагов (Macrophage migration inhibitory factor, MIF), который выделяется совместно с FKBP12.

6. Влияние MIF на кинетику агрегации АДГ. Исследование влияния MIF на агрегацию АДГ при 42 оС показало драматическое усиление агрегации в его присутствии (Рис. 16).

Нативный электрофорез в ПААГ (Рис. 17) продемонстрировал Асодержание в супернатанте димера 0.и тетрамера АДГ (молекулярные 0.массы 80 и 160 кДа соответственно).

В присутствии MIF (дорожка 3) эти 0.олигомеры обнаруживались в 0.меньшем количестве, чем в его отсутствие (дорожка 1).

0.2 4 6 8 10 12 14 На электрофореграмме Время, мин растворенного осадка (в отсутствие Рис. 16. Кинетические кривые агрегации АДГ MIF) наблюдаются пятно, (0,15 мг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии соответствующее тетрамеру АДГ, и MIF в концентрации 25 мкг/мл (2) при 42 oC в высокомолекулярные олигомеры, 25 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0.

едва проникающие в гель (дорожка 2). В присутствии MIF (дорожка 4) в осадке обнаруживаются довольно яркие полосы, которые могут соответствовать димеру и тетрамеру АДГ, а также высокомолекулярные олигомеры и полоса MIF (молекулярная масса 12 кДа), что свидетельствует об образовании гетероолигомеров, содержащих как АДГ, так и MIF.

1 2 3 4 Рис. 17. Электрофорез в неденатурирующих условиях проб после окончания процесса агрегации АДГ при 42 oC в 25 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0, последующего центрифугирования (10000g, 20 мин.). Супернатанты в отсутствие (дорожка 1) и в присутствии 25 мкг/мл MIF (дорожка 3); растворенные осадки тех же проб в отсутствие (дорожка 2) и в присутствии MIF (дорожка 4); маркеры молекулярных масс (дорожка 5).

В этом случае высокомолекулярные олигомеры располагаются в области более низких молекулярных масс (дорожка 4) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2).

На основании анализа результатов приведенных экспериментов можно сделать важный вывод о том, что при тепловом стрессе в диапазоне температур, близких к физиологическим, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков в присутствии как пептидов, так и MIF, образующиеся агрегаты оказываются легко растворимыми. Это может означать, что после снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка к нативному состоянию. В этом смысле в начале развития процесса агрегации MIF или пептиды обратимо связываются с частично денатурированным белком, стабилизируя его структуру. Однако в конечном итоге в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, эти эффекторы могут играть шапероноподобную роль.

ВЫВОДЫ 1. С использованием методов динамического лазерного светорассеяния и турбидиметрии изучена кинетика индуцируемой дитиотреитолом агрегации рекомбинантного инсулина человека, а также термоагрегации малатдегидрогеназы из сердца свиньи и дрожжевой алкогольдегидрогеназы в качестве модельных белковых субстратов.

2. Разработан новый оригинальный метод выделения из мозга быка цитоплазматического белка – иммунофилина (12 кДа), связывающего иммуносупрессор FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP12), основанный, главным образом, на высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Белок идентифицирован по результатам N-концевого микросеквенирования, масс-спектрального анализа и иммуноблоттинга.

3. Впервые показано, что FKBP12 обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в концентрационно-зависимом торможении агрегации инсулина. Предполагается, что в основе наблюдаемых эффектов лежат гидрофобные взаимодействия FKBP12 с субстратом.

4. В процессе исследования влияния электростатических взаимодействий на кинетику агрегации субстратов показано подавление агрегации алкогольдегидрогеназы и инсулина под действием аргинина (1–10 мM).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»