WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и идентификация FKBP12 из мозга быка. После тепловой o обработки ткани мозга при 58 С и последующих центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования и ионообменной хроматографии на DEAE-Toyoperl в частично очищенных низкомолекулярных фракциях выявляли FKBP-подобные белки с помощью иммуноблоттинга с использованием кроличих антител к конъюгату синтетического пептидного фрагмента (30-39) FKBP12 – (NH2SSDFKKGDEL) с овальбумином [Gurvits et al., 1999]. Фракции, проявлявшие FKBP-иммунореактивность, объединяли и исследовали на предмет выявления в них активности пептидил-пролил-цис-транс изомеразы, которую измеряли спектрофотометрически с использованием изомерспецифичного протеолиза синтетического модельного пептидного субстрата (N-сукцинил-Ala-Phe-Pro-Phe-нитроанилида) [Fischer et al., 1984]. Суммарную фракцию подвергали дальнейшей очистке с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. На профиле элюции показаны 5 мажорных и 2 минорных пика (Рис. 1).

Рис. 1. Обращенно-фазовая ВЭЖХ белков, выделенных с помощью ионообменной хроматографии. По оси ординат:

слева – оптическое поглощение при 214 нм, справа – содержание ацетонитрила (CH3CN) в элюирующем буфере (%), по оси абсцисс – время элюции (мин).

Было установлено, что FKBP выделяется преимущественно во фракции 2, что соответствует ~40% CH3CN в элюирующем буфере. По данным электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДС-Na фракция 2 содержит гомогенный белок, которому соответствует молекулярная масса около 12 кДа (Рис. 2).

Для идентификации выделенного белка, фракцию 2 лиофилизировали с помощью вакуумного концентратора Speedvac и подвергали микросеквенированию по Эдману. В результате секвенирования 37 N-концевых аминокислотных остатков была получена следующая последовательность:

NH2-GVQVЕTISPG DGRTFPKRGQ TCVVHYTGML EDGKKFD.

1 Рис. 2. Электрофорез в 12% ПААГ в присутствии ДС-Na фракции 2, элюированной с обращенно-фазовой колонки (см.

Рис. 1). Дорожка 1 – фракция 2; дорожка 2 – маркер молекулярной массы – цитохром C (12 кДа).

На основании масс-спектрального анализа было получено точное значение молекулярной массы исследуемого белка (11825,5). В результате поиска белков, содержащих приведенную выше последовательность, был идентифицирован белок FKBP12 (SwissProt, P18203).

Многократная хроматография в системе ВЭЖХ в указанных условиях с использованием препаративной колонки С18 позволили выделить FKBP12 в количествах, достаточных для анализа. Лиофилизированный белок, растворенный в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, использовали для решения поставленных задач.

2. Исследование шапероноподобной активности FKBP12. В качестве объекта исследования выбран инсулин, молекула которого состоит из двух пептидных цепей (А и В), поперечно связанных между собой двумя S–Sмостиками. Цепи А и В разделяются при денатурирующем воздействии ДТТ.

После диссоциации цепей В-цепь, в состав которой входят гидрофобные аминокислотные остатки, начинает агрегировать. При этом А-цепь не агрегирует и остается в растворе в виде индивидуального пептида.

Кинетику агрегации инсулина в отсутствие и в присутствии FKBP12 в различных концентрациях исследовали с помощью ДЛС. Выбор данного метода обусловлен тем, что его применение позволяет регистрировать не только интенсивность светорассеяния агрегатов, но и размеры частиц, образующихся в процессе агрегации.

Характер изменения во времени интенсивности светорассеяния (I) аморфных агрегатов инсулина показывает концентрационно-зависимое торможение агрегации при добавлении в инкубационную смесь FKBP12 (Рис.

3А).

Из рисунка следует, что агрегация субстрата (75 мкмоль) подавляется под действием FKBP12 при молярных субстехиометрических соотношениях FKBP12 : инсулин – (0,2 : 1), (0,4 : 1) и (0,6 : 1) соответственно. При концентрации FKBP12 45 мкмоль наблюдается заметное увеличение лагпериода (Рис. 3А, кривая 4). По истечении 60 мин инкубации интенсивность светорассеяния падает более чем в 4 раза в пробах, содержащих 45 мкмоль FKBP12, по сравнению с контролем.

Из графика изменения А величины гидродинамического радиуса (Rh) частиц во времени (Рис.

3Б, кривая 4) следует, что в присутствии FKBP12 в концентрации 45 мкмоль наблюдается заметное снижение размера агрегатов, которое 20 40 60 80 100 происходит не непрерывно (в Время, мин контроле), а дискретно. По Б 1200 истечении латентного периода ( 1000 мин) образуются стабильные 4 агрегаты, величина Rh которых сохраняется на уровне 100 нм, а затем – 350 нм в течение длительного времени агрегации.

Таким образом, торможение 5 10 15 20 25 30 35 агрегации инсулина под действием Время, мин FKBP12 проявляется не только в Рис. 3. Кинетика агрегации инсулина (0,снижении интенсивности мг/мл) в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, светорассеяния и размеров в отсутствие (1) и присутствии FKBP12 в гидродинамического радиуса концентрациях 0,2 (2); 0,4 (3) и 0,5 мг/мл (4). А.

частиц, но также в изменении Изменение интенсивности светорассеяния (I) самого характера процесса роста во времени. Б. Изменение величины гидродинамического радиуса (Rh) агрегатов агрегатов. В контроле размер Rh инсулина от времени.

составляет 1300 нм через 40 минут инкубации.

Результаты, полученные с помощью турбидиметрии, согласуются с данными ДЛС. В этом случае также наблюдается концентрационно-зависимое I (фотоотсчет/с) h R (нм) подавление агрегации инсулина в присутствии FKBP12. Данные результаты представлены на Рис. 4.

Наиболее заметное действие FKBP12 было выявлено уже при Аконцентрации 0,4 мг/мл 0.(торможение агрегации на ~50%).

0.Результаты свидетельствуют о 0.том, что FKBP12 обладает 0.10 шапероноподобной активностью, 4 проявляющейся в защите инсулина 0.от агрегации. На основании 0.анализа трехмерной структуры 20 40 60 Время, мин FKBP12 сделан вывод о том, что в Рис. 4. Кинетика агрегации инсулина (0,2 мг/мл) основе проявления данной в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, в активности лежат гидрофобные отсутствие (1) и присутствии FKBP12 в взаимодействия. Гидрофобные концентрациях 0,2 (2); 0,4 (3) и 0,5 мг/мл (4).

аминокислотные остатки сосредоточены в области расположения -тяжей, экспонированных наружу.

Однако, наряду с гидрофобными взаимодействиями, в образовании агрегатов, а также в стабилизации белковой глобулы участвуют и электростатические связи. Для выявления влияния электростатических сил на исследуемые процессы изучали агрегацию белков в присутствии свободных аминокислот, содержащих положительно заряженные боковые группы (Arg, Lys и их аналоги).

3. Исследование влияния аргинина на агрегацию модельных белковых субстратов. Mетодом ДЛС изучали кинетику агрегации АДГ при различных концентрациях A субстрата при температуре 48 oC в 25 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0.

Изменение интенсивности светорассеяния во времени в отсутствие и в присутствии аргинина представлено на рисунке 5A.

0 20 40 60 80 Время, мин Рис. 5. Кинетика термоагрегации АДГ 3 (0,2 мг/мл) в 25 мМ Tris-HCl буфере, pH Б 7,0, при температуре 48 oC. A. Изменение интенсивности светорассеяния во времени в отсутствие (1) и в присутствии аргинина 2 мМ (2), или 100 мМ NaCl (3).

Б. Изменение размера гидродинамического радиуса агрегатов 1' во времени в отсутствие (1) и в присутствии 2 мМ аргинина (2), или 20 40 60 80 Время, мин мМ NaCl (3).

I (фотоотсчет/с) h R (нм) Интенсивность светорассеяния агрегатов АДГ увеличивается в процессе инкубации и достигает предельного значения при тепловом воздействии в течение 60 минут (Рис. 5A, кривая 1). При добавлении аргинина наблюдается концентрационно-зависимое уменьшение интенсивности светорассеяния (данные не показаны). При концентрации аргинина 2 мМ агрегация субстрата полностью подавляется (Рис. 5A, кривая 2).

Из графика изменения гидродинамического радиуса (Rh) частиц во времени следует, что при агрегации АДГ в присутствии аргинина величина Rh колеблется в диапазоне 10–20 нм и остается постоянной в течение 100 минут (Рис. 5Б, кривая 2).

Формирование агрегатов АДГ в контроле характеризуется сложной динамикой изменения радиусов частиц. Для распределения агрегатов при концентрации АДГ 0,2 мг/мл характерен переход от унимодального распределения частиц к бимодальному (Рис. 5Б, кривые 1 и 1’). Действие аргинина проявляется в торможении образования агрегатов больших размеров.

В процессе исследования влияния на процесс агрегации электростатических взаимодействий было показано, что 100 мМ NaCl оказывал противоположное действие по сравнению с аргинином. В аналогичных экспериментальных условиях наблюдалось ускорение процесса агрегации, увеличение интенсивности светорассеяния и величины Rh (Рис. 5A и Б, кривые 3).

Исследование кинетики изменения величины Rh от времени при различных 3000 2' концентрациях АДГ (0,15, 0,2 и 1' 0,25 мг/мл) показало, что при 5 10 Время, мин концентрации 0,15 мг/мл 1500 наблюдается бимодальное распределение частиц. Наряду с 2' 1' агрегатами с низким значением Rh 20 40 60 80 100 (Рис. 6, кривая 1’), регистрируются Время, мин агрегаты большого размера Рис. 6. Изменение величины (кривая 1). Однако в начальный гидродинамического радиуса (Rh) агрегатов во период агрегации (до 5 минут) времени при концентрациях АДГ 0,15 мг/мл (1 и кинетика характеризуется 1’), 0,2 мг/мл (2 и 2’) и 0,25 мг/мл (3) при 48 oC в 25 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0. Вставка унимодальным распределением показывает распределение Rh от времени в частиц. При концентрации 0,начальный период агрегации.

мг/мл время унимодального распределения частиц увеличивается, достигая 10 минут. Величина Rh частиц (кривые 1’ и 2’) колеблется в диапазоне 100–350 нм и сохраняется практически на одном уровне в течение всего процесса агрегации, в то время как величина Rh частиц большего размера драматически увеличивается во времени (кривые и 2). При концентрации 0,25 мг/мл в течение по меньшей мере 100 минут наблюдается формирование агрегатов большого размера с мономодальным распределением частиц (кривая 3). Мономодальное распределение частиц было h R ( нм ) h R (нм) показано также для агрегации АДГ в присутствии 2 мМ аргинина и 100 мМ NaCl (Рис. 5Б).

Можно предположить, что бимодальное распределение агрегатов АДГ в контроле связано с олигомерной структурой препарата фермента.

В соответствии с электрофорезом в неденатурирующих условиях препарат фермента АДГ представлен димером и тетрамером, тогда как на электрофорезе в присутствии ДС-Na наблюдается полоса гомогенного мономера субстрата с молекулярной массой около 40 кДа (Рис. 7А и Б).

Рис. 7. Электрофорез в ПААГ в нативных (A) и денатурирующих (Б) условиях. Коммерческий препарат АДГ (дорожки 1); маркеры молекулярных масс (дорожки 2): бычий сывороточный альбумин (БСА) – мономер, димер, тример (67, 134 и 201 кДа соответственно) и химотрипсиноген (24 кДа).

Появление двух стереотипов агрегатов может быть связано с различными конформационными изменениями в олигомерах в условиях стресса.

Формирование различных стереотипов популяций агрегатов в результате различных конформационных переходов олигомеров наблюдали у большого числа других белков [Militello et al., 2004; Majhi et al., 2006; Bettelheim et al., 1999].

Кинетика агрегации инсулина. Продемонстрировано торможение кинетики агрегации инсулина (0,2 мг/мл) в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, в результате действия 8,5 мМ аргинина (Рис. 8).

A Рис. 8. Действие аргинина (8,5 мМ) на 60000 кинетику агрегации инсулина (0,мг/мл) в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0. Изменения интенсивности светорассеяния (А) и размеров гидродинамического радиуса (Б) агрегатов инсулина во времени в 20 40 60 80 100 отсутствие (1) и в присутствии аргинина Время, мин (2).

Б 3000 Показано, что в течение минут процесса агрегации не наблюдается прироста интенсивности светорассеяния 2 агрегатов инсулина, при дальнейшей инкубации происходит незначительное увеличение уровня 20 40 60 80 100 интенсивности (Рис. 8А, кривая 2).

Время, мин При анализе размеров агрегатов выявлено их I (фотоотсчет/с) h R (нм) унимодальное распределение во времени в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2) аргинина. Лишь по истечении 60 минут инкубации наблюдалось увеличение значения Rh (Рис. 8А).

Результаты, полученные с помощью турбидиметрии, согласуются с данными ДЛС (Рис. 9). Аргинин уже в концентрации 0,05 мМ оказывает заметное действие на агрегацию АДГ (Рис. 9А, кривая 2), а при концентрации мМ наблюдается почти полное подавление агрегации (кривая 5). При этом происходит значительное увеличение продолжительности лаг-периода.

С помощью данного метода было также показано концентрационнозависимое подавление агрегации инсулина (0,2 мг/мл) в присутствии аргинина (Рис. 9Б). Значительный эффект наблюдался при его концентрации, равной мМ, а при концентрации 8,5 мМ – почти полное подавление процесса, АA 0.08 1 что сопровождалось увеличением длительности лаг-периода (кривые 0.4 и 5). Полученные данные отличаются высокой 0.воспроизводимостью во многих 0.сериях экспериментов, выполненных при использовании 0.5 10 15 20 25 30 35 АДГ и инсулина в качестве Время, мин субстратов.

А360 Б Таким образом, на двух 0.модельных системах было показано защитное действие аргинина при 0.физиологических концентрациях, направленное на торможение 0.процесса агрегации.

На рисунке 10 (А и Б) 0.5 10 15 20 25 30 представлены кинетические Время, мин параметры агрегации. С помощью Рис. 9. А. Агрегация АДГ (0.2 мг/мл), программы Origin Pro 7.0 были зарегистрированная с помощью турбидиметрии рассчитаны предельное поглощение при 48 °С в 25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, в при t (Alim) и константа отсутствие (1) и присутствии аргинина в скорости 1-ого порядка (k1) по концентрациях 0.05 (2); 0.3 (3); 1 (4); 2 (5) мМ.

формуле y=Alim*(1-exp(-k*(x-t0))).

Б. Агрегация инсулина (0.2 мг/мл) в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) При увеличении концентрации и присутствии аргинина в концентрациях 0.аргинина значения Alim, и k(2); 2 (3); 4 (4); 8.5 (5) мМ.

уменьшаются. Эти характеристики не только подтверждают защитную роль аргинина, но и позволяют оценить концентрацию эффектора, вызывающую максимальное подавление агрегации.

Ранее сообщалось, что аргинин обладает защитным действием только в больших концентрациях (0,1–2,0 М), указывая на слабое взаимодействие «аргинин-белок». Данные о действии аргинина в микро- и миллимолярных концентрациях при фолдинге и агрегации белков ограничены. В наших исследованиях, было показано, что аргинин тормозит агрегацию белков в низких концентрациях (0,1–10 мМ).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»