WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ЛЮТОВА Елена Михайловна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ШАПЕРОНОПОДОБНОГО ДЕЙСТВИЯ АМФИФИЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин доктор биологических наук Н.П. Шарова

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Защита состоится «_» ноября 2007 г. в. часов на заседании 13 1400 диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_» 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большой интерес к изучению механизмов действия особого класса белков – «молекулярных шаперонов», основной функцией которых является участие в сворачивании полипептидных цепей в нативную структуру, вызван проблемами, связанными с процессами денатурации и агрегации белков вследствие нарушения их конформации при стрессорных воздействиях различного характера.

Молекулярные шапероны обладают способностью взаимодействовать с развернутыми или неправильно свернутыми белками, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации. Подобное взаимодействие приводит в конечном итоге к сохранению или восстановлению нативного состояния белков.

Многообразие действия шаперонов велико: они участвуют в различных внутриклеточных процессах, в том числе в котрансляционном фолдинге полипептидных цепей при их биосинтезе, транслокации белков через мембраны, включении индивидуальных белков в надмолекулярные структуры, они способствуют также солюбилизации агрегатов белков и их корректному рефолдингу.

Исследования последних лет показали, что традиционные представления о сохранении биологически активной конформации белков в денатурирующих условиях не ограничиваются сведениями о защитных свойствах молекулярных шаперонов. Процессы фолдинга могут осуществляться под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза) и различные шапероноподобные белки. К этим белкам можно отнести тубулин, казеин, фактор ингибирования миграции макрофагов и др. [Guha et al., 1998; Bhattacharyya, Das, 1999; Souza et al., 2000;

Cherepkova et al., 2006]. Кроме того, оказалось, что пептидные фрагменты известных шаперонов (протеиндисульфидизомеразы и альфа-кристаллина) и их синтетические аналоги проявляют шаперонные свойства [Puig et al., 1997;

Deuerling et al., 1999; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001]. Было обнаружено также, что шаперонная активность присуща изолированным пептидным фрагментам (и их синтетическим аналогам) молекул некоторых белковых субстратов, в частности, дрожжевой алкогольдегидрогеназы [Bhattacharyya et al., 2003].

Несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов, структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны. В соответствии с современными представлениями действие шаперонов осуществляется в результате их связывания с гидрофобными участками молекулы белкового субстрата, которые оказываются экспонированными наружу при нарушении пространственной структуры белка в состоянии стресса. Однако, наряду с гидрофобными взаимодействиями, в образовании агрегатов участвуют химические связи, аналогичные тем, которые стабилизируют белковую глобулу (вандерваальсовы силы, электростатические взаимодействия, водородные связи, дисульфидные связи и др.), которые весьма редко учитываются при изучении молекулярных механизмов действия шаперонов.

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфифильной вторичной структуры.

Представляется целесообразным также исследование защитных функций пептидов и свободных аминокислот, содержащих заряженные боковые группы.

Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов защитного действия амфифильных белков и пептидов, предотвращающих агрегацию модельных белковых субстратов в состоянии стресса.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить иммунофилин – низкомолекулярный (12 кДа) цитоплазматический рецептор иммуносупрессора FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP12) из мозга быка в гомогенном состоянии.

2. Исследовать шапероноподобную активность FKBP12 в тест-системе in vitro, основанной на торможении агрегации рекомбинантного инсулина человека, индуцированной дитиотреитолом (ДТТ).

3. Изучить молекулярные механизмы действия на кинетику агрегации белковых субстратов – малатдегидрогеназы из сердца свиньи (МДГ) и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (АДГ) свободных аминокислот, содержащих положительно заряженные боковые группы (Arg, Lys и их аналоги), а также синтетических Arg- и/или Lys-содержащих пептидов – трипептида (Ala-Phe-Lys), дипептида (Arg-Phe) и аналогов пептидного антибиотика грамицидина.

4. Проанализировать изменение состояния агрегатов, образовавшихся при тепловом стрессе, после снятия денатурирующего воздействия.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые продемонстрированы шапероноподобные свойства иммунофилина FKBP12 из мозга быка. При этом применен новый оригинальный метод выделения этого белка в гомогенном состоянии, основанный, главным образом, на обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). С помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) показано, что шапероноподобная активность FKBP12 проявляется в концентрационнозависимом уменьшении интенсивности светорассеяния и размеров (величины гидродинамического радиуса) аморфных агрегатов рекомбинантного инсулина человека.

Новые свойства иммунофилина FKBP12 могут расширить представления о его иммунологических функциях, поскольку в механизмах действия иммуносупрессоров участвуют различные белки, биологически активная структура которых может поддерживаться в присутствии FKBP12 [Snyder, Sabatini, 1995].

С использованием двух модельных систем: термоагрегации АДГ и ДТТиндуцированной агрегации инсулина показана способность свободной аминокислоты аргинина тормозить агрегацию белков в концентрациях, близких к физиологическим (0,1–10 мМ). Подавление агрегации наблюдали и в присутствии коротких Arg- или Lys-содержащих пептидов (Ala-Phe-Lys) и (Arg-Phe). Данные пептиды и аргинин могут быть предложены в качестве эффективных средств для повышения выхода биологически активных белков в биотехнологических процессах.

В частности, проблемы, связанные с получением препарата рекомбинантного инсулина биотехнологическим путем и его длительным хранением, остаются в настоящее время актуальными. В этой связи весьма перспективным представляется изучение механизмов стабилизации молекулы инсулина и предотвращения его агрегации.

Практическое значение защиты инсулина от агрегации трудно переоценить. Инсулин, который образует аморфные агрегаты при диссоциации А- и В-цепей в результате восстановления связывающих их S–S-мостиков, является одним из интереснейших объектов исследования. Исследования защитной роли шапероноподобных белков, связывающих инсулин и предотвращающих его агрегацию, могут представлять интерес для нейроэндокринологии при разработке новых подходов к терапии некоторых нейродегенеративных заболеваний, в патогенезе которых участвуют факторы, вызывающие дисфункцию инсулина.

Что касается аргинина, то учитывая его роль во многих метаболических процессах, участвующих в реализации иммунологических и эндокринных функций организма, способность этой аминокислоты влиять на конформацию белков может иметь большое значение при разработке подходов к терапии таких заболеваний как атеросклероз, диабет, сепсис и злокачественные опухоли.

При исследовании синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина с помощью турбидиметрии и ДЛС показано, что амфифильные пептиды, содержащие 27 и 21 аминокислотных остатков, а также пептиды AlaPhe-Lys и Arg-Phe при определенных условиях проявляют способность ускорять термоагрегацию МДГ и АДГ. Этим свойством обладает и низкомолекулярный (12 кДа) термостабильный белок, выделенный из мозга быка, – фактор ингибирования миграции макрофагов (Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF). Однако, несмотря на значительное увеличение размеров агрегатов, образовавшиеся белковые агрегаты оказывались способными к растворению. Предполагается, что в начале развития процесса агрегации (при температурах, близких к физиологически допустимому уровню) эффекторы, обратимо связываясь с развернутым белком, стабилизируют его структуру.

После снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка. В этом смысле исследуемые эффекторы могут играть шапероноподобную роль.

Полученные данные, затрагивающие молекулярные механизмы ускорения/подавления агрегации белков с помощью амфифильных низкомолекулярных белков и пептидов, могут дать дополнительную информацию для разработки эффективных добавок с целью оптимизировать процесс фолдинга рекомбинантных белков, а также для создания лекарственных средств, способных предотвращать так называемые «конформационные» заболевания.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 9-ой Пущинской школе – конференции молодых ученых.

“Биология – наука ХХI века” (Пущино, 2005); на Международном симпозиуме “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки” (Тюмень, 2005); на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005); на научной конференции “Нейрохимия:

фундаментальные и прикладные аспекты” (Москва, 2005); на XVIII зимней молодежной научной школе “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2006); на 21-й Объединенной конференции Международного и Американского Нейрохимических обществ (ISN/ASN) (Мексика, 2007).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в том числе 6 статей в ведущих российских и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы содержит наименований, в том числе на иностранных языках.

Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

Сокращения, принятые в тексте. АДГ – алкогольдегидрогеназа; МДГ – малатдегидрогеназы; БСА – бычий сывороточный альбумин; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; ДЛС – динамическое лазерное светорассеяние; ДС-Na – додецилсульфат натрия; ДТТ – дитиотреитол; ПААГ – полиакриламидный гель; Аlim – предельное кажущееся поглощение при t;

DEAE – diethylaminoethyl; FKBP – FK506-binding protein; MIF – Macrophage migration inhibitory factor.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение FKBP12 из мозга быка. Разработан оригинальный метод выделения FKBP12 в гомогенном состоянии, включающий гомогенизацию ткани мозга, полученного на мясокомбинате, нагревание гомогената (58 оС, мин), центрифугирование, ультрафильтрацию, концентрирование, ионообменную хроматографию и обращенно-фазовую ВЭЖХ на аналитической колонке C18 (Aquapore RP 300). Выделенный белок идентифицировали с помощью автоматического N-концевого микросеквенирования по Эдману и масс-спектрального анализа.

Определение шаперонной активности. Использовали тест-систему, основанную на подавлении агрегации модельных белковых субстратов.

Кинетику термоагрегации МДГ и АДГ в 25 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0, и агрегации инсулина, индуцированной ДТТ (20 мМ) при комнатной температуре в 100 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,0, в отсутствие и в присутствии различных концентраций эффекторов изучали методом ДЛС. Исследования проводили при помощи установки фотометра рассеянного лазерного света (Photocor Instruments Inc., США), снабженной He-Ne лазером, мощностью мВт и длиной волны падающего света 632.8 нм. Исследование динамики флуктуаций интенсивности рассеянного света при прохождении лазерного луча и изменения кажущегося размера наночастиц – гидродинамического радиуса (Rh) в диапазоне от 1 нм до 5 мкм в анализируемой суспензии в отсутствие или в присутствии шапероноподобных белков или пептидов позволяет оценить эффективность их действия. Анализ данных проводили с помощью персонального компьютера с использованием программного обеспечения PhotoCor (версии 5.3.3) и DynaLS (версии 2.5.2).

Применяли также турбидиметрический метод (с использованием спектрофотометра Beckman DU-650), позволяющий регистрировать изменение кажущегося оптического поглощения белков в процессе их агрегации при нм. Пробы, полученные после тепловой агрегации, центрифугировали (10000 g, 20 мин). Осадки растворяли в 100 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0. Полученные образцы анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях.

Для расчета молярных стехиометрических соотношений (эффектор :

субстратный белок) использовали значения молекулярных масс субъединиц МДГ, АДГ и инсулина – 35, 37 и 3 кДа соответственно.

Электрофорез проводили в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДС-Na) или в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях. Белок проявляли нитратом серебра.

Концентрацию белка определяли по методу Bradford.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»