WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Европиевые наночастицы Наряду с получением новых меток, другим направлением в химии лантанидных хелатов является увеличение чувствительности существующих.

Использование европиевых наночастиц (NP) размером 100-200 нм в флуоресцентном иммуноанализе приводит к значительному увеличению сигнала флуоресценции, т.к. каждая наночастица содержит тысячи флуоресцирующих комплексов европия с –дикетонами. Описано применение наночастиц для детекции предельно низких концентраций простат специфического антигена.

В данной работе использовали европиевые NP диаметром 120 нм производства фирмы Seradyn. Наночастицы на своей поверхности содержат карбоксильные группы для ковалентного связывания. Присоединенение стрептавидина к таким наночастицам - быстрый и нетрудоемкий способ, не требующий последующей очистки конъюгата на колонках: конъюгат отмывается центрифугированием.

При разработке анализа выяснилось, что конъюгат наночастиц со стрептавидином (NP-StAv) обладает высоким неспецифическим связыванием с поверхностью лунок полистирольного иммунологического планшета. Было изучено поведение компонентов в буфере следующего состава: 0.5 М трис-HCl, 0.15 М NaCl, 0.5% БСА, 0.02% Тритон X-100, 2 мг/мл натрия салицилата, 1 мМ ЭДТА, рН 7.75. Подобный состав буфера позволил снизить неспецифику и коэффицент вариации при разработке анализа с T4 –ДТПА-Eu. Использование этого буфера, а также добавление 0.1% гетерологичных антител и 0.5 % фетальной сыворотки позволили снизить отношение специфического сигнала к неспецифическому в 100 раз (рис.9). Кривая проходит через максимум, который определяет оптимальную концентрацию конъюгата StAv-NP для конкурентного анализа тироксина, что соответствует 10–13 М для выбранной концентрации моноклональных антител (200нг/мл).

Для европиевых наночастиц была выбрана двустадийная схема ФИАВР с иммобилизованным антигеном. Концентрация иммобилизованного на поверхности лунки антигена составила 10 мкг/мл. Для этой концентрации динамический диапазон сигнала определялся как максимальный. T4 - стандарты добавляли перед внесением мАт в лунку. Было установлено, что концентрация -10 нг биотинилированных антител на лунку (не более 70% насыщающей)- являлась оптимальной для конкурентного анализа.

Иммобилизованный и свободный тироксин конкурировали за центры связывания биотинилированных мАт (рис.10). Для достижения равновесия в системе было достаточно 2.5 часов. NP-StAv добавляли после отмывки в концентрации 10–13 М и инкубировали 2 ч. Флуоресценцию измеряли без усиливающего раствора с поверхности дна осушенных лунок. Предел детекции для Т4 составил 100 пикомоль/л (1 фемтомоль тироксина на 10 мкл образца) (рис.11). Коэффициент вариации исследуемого диапазона не превышал 8-10%.

Мы уже использовали аналогичную, но одностадийную диссоциативную схему имуноанализа. с мАт-Eu –ИТЦ ДТТА-Eu (рис. 8). Хотя анализ с наночастицами проводится в два этапа, его преимуществом является 70кратное увеличение чувствительности по сравнению с чувствительностью анализа с мАт–ИТЦДТТА-Eu. Калибровочная кривая для анализа с наночастицами покрывает диапазон концентраций 0.1-10 нМ, для анализа с мАт –ИТЦ ДТТА-Eu этот диапазон - 7-500 нМ, т.е. в обоих случаях динамический диапазон покрывает два порядка концентраций. В указанных пределах сигнал флуоресценции линейно зависит от концентрации тироксина в образце (рис.12).

Рисунок 9. Влияние состава буфера на отношение специфическое (в присутствии 200 нг/мл моноклональных антител к тироксину) /неспецифическое связывание (в отсутствии мАт) NP-StAv в (1) 2 мМ Трис, pH 7.(2) 0.05 M Трис-HCl буфере содержащем 0.15М NaCl, 0.5% БСА, 0.02% Тритона X-100, 0 мг /мл натрия салицилата, 1 мM ЭДТА, 0.5% фетальной сыворотки, 1E-13 1E-12 1E-0.1% IgG, pH 7.NP-StAv, M Отношение сигнал/фон Рисунок 10. Схема недиссоциативного ФИАВР с использованием моноклональных антител, меченных биотином, и европиевых наночастиц, покрытых стрептавидином.

Рис.11. Калибровочная кривая для определения 1,0 1,тироксина в недиссоциативном ФИАВР с использованием NP-StAv 0,8 0,T4-БСА -10 мкг/мл, мАтбиотин -200 нг/мл, NP-StAv - 10–13 М.

0,6 0,F/F0 -отношение сигнала флуоресценции в присутствии определяемого 0,4 0,аналита (Т 4) к сигналу в отсутствие вышеуказанного.

0,2 0, F0 = 959 948 у. е.ПД = 0,1 нМ при КВ не более 10 % (n=8).

0,0 0,0,1 1 lg [T4], нМ КВ F/F Рис.12. Калибровочные кривые для определения 1,тироксина в недиссоциативном анализе с NP-StAv (1) и 0,диссоциативном с мАтИТЦДТТА-Eu ФИАВР (2).

0,(1) концентрации T4-БСА 10 мкг/мл, мАт-биотин -0,нг/мл, NP-StAv - 10–13 М.

F0 = 959 948 у.е.

ПД = 0,1 нМ при КВ не 0,более 10 % (n=8).

(2) концентрации T4-БСА 0,0,33 мкг/мл, мАт- ИТЦДТТА Eu -250 нг/мл.

-0,F0 = 226 684 у.е.

0,1 1 10 ПД = 7 нМ при КВ не более T4,нМ 8-10 % (n=6).

Другое преимущество анализа с европиевыми наночастицами – это нечувствительность раствора и образца к загрязнению солями лантанидов, т.к.

европиевые комплексы изолированы от окружения латексной полимерной оболочкой наночастиц. Следующее преимущество заключается в том, что для анализа можно использовать меньшее количество метки (10 мкл вместо 50 мкл для диссоциативного ФИАВР), т.к. флуоресценция измеряется с поверхности дна лунки, а не со всего заданного объема.

Таким образом, наночастицы могут использоваться для детекции тироксина в ФИАВР и позволяют определять фемтомоли исследуемого вещества с полученными мАт.

Данная технология впервые продемонстрирована для низкомолекулярного гаптена и может быть использована для целей неонатального скрининга, т.к. позволяет достигать высокой чувствительности в определении тироксина в сухих пятнах крови.

F/F ВЫВОДЫ:

1) Получены моноклональные антитела к тироксину. Для разработки анализа выбраны мАт 6Е6Е5 с константой связывания 108 М-1, сохраняющие свои иммунологические свойства на протяжении длительного времени.

2) На основе полученных моноклональных антител и тироксина, меченного ДА ДТПА, разработан метод определения тироксина в сухих пятнах крови.

Данный метод позволяет определять общий тироксин с пределом детекции нМ и коэффициентом вариации не более 15 %.

3) Разработан трифункциональный хелат, по чувствительности не уступающий бифункциональным хелатам, используемым в диссоциативных схемах. Разработаны методы получения коньюгатов с новой флуоресцентной меткой на основе N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и изучены их флуоресцентные свойства.

4) Впервые показано использование нового трифункционального хелата в иммунофлуоресцентном твердофазном гетерогенном анализе тироксина в схеме с мечеными антителами и иммобилизованным антигеном. Предел детекции тироксина составил 7нМ с коэффициентом вариации не более 10%, что соответствует чувствительности диссоциативного ФИАВР для определения тироксина в той же схеме.

5) Использование нового трифункционального комплексона сокращает время анализа, который проводится в одну стадию, исключает использование усиливающего раствора, снимает проблему загрязнения иммуноаналитической системы солями лантанидов и тяжелыми металлами.

6) Впервые продемонстрировано использование европиевых наночастиц в конкурентном анализе гаптенов, в частности, для определения тироксина.

Данный анализ позволяет определять тироксин в концентрации 0,1нМ и демонстрирует 70-кратное увеличение чувствительности по сравнению с диссоциативным флуоресцентным иммуноанализом в схеме с иммобилизованным антигеном.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Жердева В.В.., Диденчук И.В., Савицкий А.П.., Моноклональные антитела к гормону тироксину. - Материалы конференции «Горизонты физикохимической биологии»,Пущино, 2000, 28 мая-2 июня, т.2, с. 90.

2. Чудинов А.В, Жердева В.В,, Грибкова Е.В., Савицкий А.П. Новые фотолюминесцентные метки для иммуноанализа. – Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, т.1, с. 143-150.

3. Жердева В.В., Чудинов А.В., Савицкий А.П. Разработка иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением для определения гормона тироксина в сухих пятнах крови. - Материалы I Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».14-18 октября 2002, стр.56.

4. Жердева В.В., Володаева Л.А., Савицкий А.П. Использование европиевых наночастиц для иммунофлуоресцентного анализа тироксина. Материалы III Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».14-18 марта, 2005, стр. 90.

5. Жердева В.В., Чудинов А.В., Савицкий А.П. Использование метода лантанидного флуоресцентного иммуноанализа для определения гормона тироксина в сухих пятнах крови. - Биомед. химия,. 2003, т.49, с.70-79.

6. Jerdeva V.V., Volodaeva L. A., Savitsky A. P. Using of europium nanoparticles as a reporter in thyroxin fluorescent immunoassay. – «Biotechnology in Biology and Medicine». Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Egorov, Ed.), 2006, p.

5-12.

7. Жердева В.В., Володаева Л.А., Савицкий А.П. Европиевые наночастицы для иммунофлуоресцентной детекции тироксина. В сборнике: Вестник научнопромышленного общества, М: «Алев-В», 2006, вып.10, c.81-86.

8. Жердева В.В., Чудинов А.В, Носыркова Н.В., Володаева Л.А., Савицкий А.П. Использование различных флуоресцентных меток для определения тироксина в конкурентном лантанидном иммуноанализе. - Физиология и патология иммунной системы, 2006, №4, стр.9-19.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»