WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Т4 В ДИССОЦИАТИВНОМ ФИАВР В СХЕМЕ С МЕЧЕНЫМ АНТИГЕНОМ (Т4-ДТПА-EU) В БУФЕРЕ И СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ Для определения низкомолекулярного аналита, каким является тироксин, подходят два типа конкурентного твердофазного анализа:

(1) за центры связывания мАт конкурируют Т4 в образце и меченый Т4 (рис.1) (2) за центры связывания меченных мАт конкурируют Т4 и конъюгат тироксина с белковым носителем, адсорбированный на планшете (рис.4, раздел III) При получении коньюгатов тироксина с низкомолекулярными соединениями необходимо сохранение его антигенных детерминант. Учитывая, что первичная аминогруппа тироксина не участвует в его распозновании моноклональными антителами, маркирование производили по первичной аминогруппе. Для разработки диссоциативного ФИАВР с меченым антигеном в качестве метки использовали Т4-ДТПА-Eu.

Важным моментом при разработке аналитических систем является минимизация неспецифического связывания компонентов системы, что достигается варьированием условий проведения анализа и варьированием компонентов буферных систем данной аналитической системы. Были приготовлены буферы на основе 50 мМ Трис 0,15M NaCl рН 8,5 с добавлением разных компонентов, которые должны снять неспецифическую адсорбцию гидрофобной части тироксина и хелата в процессе проведения анализа. Состав буфера для определения гормона тироксина обычно содержит 50 мМ Трис-HCl, 0.15 М NaCl, 0.02% Tритон X-100, 0.5% БСА, 0.01% 1-анилино-8нафталинсульфоната (АНС), рН 7,8-8.5. Стадия предынкубации с буфером, содержащим ДТПА 10-5М, Са+2 10-5М, была введена для снижения фона. При этом происходило связывание ионов тяжелых металлов, следовые количества которых влияют на проведение лантанидного анализа, и, одновременно, удаление следовых количеств лантанидов, которые содержались в воде и солях, используемых для приготовления буферов. В литературе указывается, что добавление 2мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в буфер для хранения конъюгатов европия стабилизирует активность некоторых из них. В наших экспериментах добавление 2мМ ЭДТА в буфер для хранения и в буфер для анализа приводило к минимизации фонового сигнала до фона усиливающего раствора, а добавление салицилата натрия в количестве 2 мг/мл вызывало увеличение динамического диапазона регистрации сигнала. Таким образом, для анализа тироксина был предложен буфер следующего состава: мМ трис-HCl, 0.15 М NaCl, 0.02% TритонX-100, 0.15% СИТ, 0.01% АНС, 2мМ ЭДТА, 2 мг/мл салицилата натрия, рН 7,8.

Для определения тироксина в данной схеме анализа была выбрана концентрация метки Т4-ДТПА-Eu 0,5 нМ, при которой при концентрации антител 0,75 мкг/мл диссоциация комплекса мАт и Т4-ДТПА-Eu происходит не более чем на 50%. Результаты определения тироксина в схеме с Т4-ДТПА-Eu представлены в виде калибровочной кривой (рис.2). Предел детекции тироксина составил 0,5 нМ (n=6) при коэффициенте вариации не более 10%. Диапазон определяемых концентраций (0,1-150 нМ) позволял применить данную схему для определения тироксина в сухих пятнах крови.

Рисунок 1. Схема конкурентного твердофазного диссоциативного ФИАВР с использованием тироксина, меченного европием, и иммобилизованными антимышиными иммуноглобулинами.

Рис.2. Калибровочная кривая для определения Т4 в 1,конкурентном диссоциативном анализе с Т4-ДТПА0,Eu. Антимышиные IgG адсорбированы в концентрации 0,мкг/мл.

[мАт]=- 0, 75 мкг/мл [Т4-ДТПА-Eu] =0,0,нМ.

В/В0 --отношение 0,2 сигнала флуоресценции в присутствии Т4 к 0,сигналу в отсутствии 0,1 1 Т4.

lg [T4], nM ПД=0,5 нМ КВ <11% Сигнал флуоресценции, В/В Сухие пятна крови используются для диагностики врожденных заболеваний у детей, таких как гипотиреоз (ВГ), фенилкетонурия и т.д.

Использование сухих пятен крови, а не образцов сыворотки, взятых у новорожденных, более удобно. Это снимает проблему консервации крови, краткосрочности ее хранения и транспортировки.

Для диагностики ВГ в России измеряют концентрацию тиреотропного гормона (ТТГ) в сухих пятнах крови, которая берется у доношенных новорожденных на 4-5ый день после рождения, у недоношенных детей - на 714-ый день жизни. Если во многих странах скрининг на Т4 и ТТГ проводится одновременно, то в России скрининг на Т4 проводится в случае положительного ответа на повышенный уровень ТТГ. Это требует повторного взятия крови у новорожденных, при этом определяют Т не в сухих пятнах, а в сыворотке крови. Одновременное определение и ТТГ, и Т4 позволило бы избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а также многих ошибок манипулирования. Поэтому актуальной является разработка анализа на Т4 в сухих пятнах крови в качестве подтверждающего теста на ВГ.

Концентрация общего тироксина у здоровых новорожденных находится в диапазоне 190-407 нМ, у детей с подозрением на ВГ - в диапазоне 79-98 нМ.

Калибровочная кривая для определения Т4 в сухих пятнах крови покрывает диапазон концентраций 10-400 нм (рис.3), достаточный для определения общего тироксина. Предел детекции тироксина в сухих пятнах составил 10 нМ (n=8) при коэффициенте вариации 15%. При проведении того же анализа исключительно в буферной системе с использованием Т4-стандартов предел обнаружения Т4 составил 0,5 нМ, что соответствует пределу детекции в сухих пятнах крови с учетом разбавления образцов в 20 раз в лунке. Таким образом, десорбция тироксина в разработанном буфере для анализа протекала практически на 100%.

Рис.3.

0,7 100% Калибровочная кривая для определения Т 4 в 0,сухих пятнах крови.

80% Антимышиные IgG 0,адсорбированы в концентрации 60% 0,мкг/мл.

[мАт]=- 0, 75 мкг/мл [Т4-ДТПА-Eu] =0,0,40% нМ.

В/В0 -отношение 0,сигнала флуоресценции в 20% присутствии Т4 к 0,сигналу в отсутствии 0,0 0% вышеуказанного.

10 100 ПД = 10 нМ при Концентрация Т4 в калибровочных пробах,нМ КВ < 15% (n=8) калибровка КВ Таблица 3. Значения истинных концентраций Т 4 в контрольных сыворотках (Уровень 1, Уровень 2, Уровень 3) набора межлабораторного контроля качества Lipochek Immunoassay Plus Control Kit TM и концентраций Т (Х1, Х2, Х3) в сухих пятнах крови Уровень 1 (Х1) Уровень 2 (Х2) Уровень 3 (Х3) Истинные концентрации и 35 нМ 76 нМ 150 нМ допустимый интервал 25 нМ - 46 нМ 61 нМ - 91 нМ 120 нМ - 180 нМ Определяемые 39нМ± 4 нМ 82нМ±8нМ 170нМ±17нМ концентрации В отечественной литературе сообщали о получении мАт с Каф 3*109М-1.

Предел детекции тироксина в сыворотке, определяемый в ИФА с помощью этих антител, составил 10 нг/мл (11нМ). Он соответствует пределу детекции тироксина в сухих пятнах крови в разработанном нами анализе, но с использованием антител с Каф 108М-1. Таким образом, даже при использовании Сигнал флуоресценции, B/B Коэффициент вариации (КВ) % мАт с константой аффинности на порядок ниже по сравнению с опубликованной можно получить такой же предел детекции, что говорит о высокой чувствительности лантанидной метки. Для проверки достоверности анализа в качестве неизвестных проб были взяты контрольные сыворотки (Уровень 1, Уровень 2, Уровень 3) набора межлабораторного контроля качества TM Lipochek Immunoassay Plus Control Kit ("BioRad", США). Сыворотки были предварительно нанесены на бумагу Shleiher&Schull 2992 по той же схеме, что и калибровочные пробы. Значения концентраций Т4 для диссоциативного ФИАВР, указанные в описании к набору сывороток, и значения концентраций Х1, Х2, Х3, рассчитанные по уравнению линии тренда калибровочной кривой, представлены в табл.3. Определяемые концентрации попадали в доверительный интервал истинных концентраций. Это говорит о высокой точности метода и возможности его применения в клинической диагностике.

III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Т4 В СХЕМЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ АНТИГЕНОМ (Т4БСА) С РАЗНЫМИ ЕВРОПИЕВЫМИ МЕТКАМИ В качестве бифункциональных хелатирующих агентов наиболее часто используются производные поликарбоновых кислот (ПК), которые обеспечивают высокую стабильность комплексов с ионами Eu и прочное связывание с белком. Наряду с ранее предложенными изотиоцианатофенильными производными ПК в литературе описано использование более доступных, легко синтезируемых диангидридов ДТПА.

Метки более нового поколения – трифункциональные - в своем составе содержат еще и сенсибилизатор флуоресценции.

В данной работе использовали новые трифункциональные флуоресцентные метки: конъюгат N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и латексные европиевые наночастицы. Выбранная схема иммуноанализа с иммобилизованным антигеном, где за центры связывания мАт к гаптену (тироксину) конкурируют свободный и конъюгированный гаптены, позволила оценить перспективу использования новых меток во флуоресцентном анализе с временным разрешением по сравнению с бифункциональной ИТЦ ДТТА-Eu.

Диссоциативный ФИАВР с мАт- ИТЦ ДТТА-Eu Рисунок 4. Диссоциативный ФИАВР с мАт- ИТЦ ДТТА-Eu в схеме с иммобилизованным антигеном.

Количество антигена, иммобилизованного на поверхности лунок, выбирали следующим образом. Во-первых, в отсутствии тироксина концентрация антител должна быть меньше 70% от насыщающей концентрации. Во-вторых, в присутствии тироксина выбранная концентрация антител должна давать достаточный динамический диапазон (от 0 до 400нм) для определения тироксина и давать хорошее замещение на 400 нм. Было установлено, что концентрация 0.33 мкг/мл и 250 нг мАт на лунку является оптимальным. Предел детекции тироксина в образце в анализе с мАт- ИТЦ ДТТА-Eu составил 7нМ (n=8), КВ< 8% (рис.8).

В этой же схеме с иммобилизованным антигеном был изучен новый хелат N-ГСИЭ- ДТПА – АБТФА.

Новый хелат N-ГСИЭ- ДТПА - АБТФА для недиссоциативного ФИАВР Из структурной формулы N- ГСИЭ- ДТПА - АБТФА (рис.5) можно предположить, что в координации иона европия будут принимать участие три атома азота, шесть атомов кислорода молекулы ДТПА и два атома кислорода молекулы АБТФА. Таким образом, этого количества лигандов должно быть достаточно для заполнения первой координационной сферы европия, координационное число которого составит 8-9. Это должно обеспечить хорошее удержание иона РЗЭ в составе этого хелата.

1000-кратный избыток был использован для синтеза конъюгата с БСА и с мАт. Степень мечения в этом случае составила 8-10 молекул АБТФА на молекулу БСА и 4-6 молекулы на молекулу иммуноглобулина. Профиль элюции состоял из двух пиков: с меченым белком в первом пике и непрореагировавшим хелатом во втором. Молярное соотношение АБТФА / белок рассчитывали по формуле:

АБТФА /белок= (А330/ АБТФА 330) / ((А280-0,719 А330)/ белок ), где АБТФА = 11 500 М-1 cm-1, АБТФА = 5000 М-1 cm-1, БСА = 65000 М-1 cm-1, 330 280 IgG280 = 200 000М-1 cm-1.

Спектры поглощения конъюгата БСАДТПА-АБТФА представлены на рис.6А.

Наблюдаются две полосы поглощения:

с максимумом на 280 нм, соответствующая поглощению белка, и с максимумом на 330 нм, соответствующая поглощению АБТФА.

Спектры испускания представлены на Рис.5.N- гидроксисукцинимидный рис.6 Б. Отношение величины пика на эфир коньюгата парааминобензоилтрифторацетона с диэтилен618 нм к величине пика на 700 нм триаминпентауксусой кислотой составляет 10.6 при длине волны возбуждения 340 нм.

Эти максимумы имеют лантанидное происхождение, испускание происходит благодаря резонансному переносу энергии с -дикетонов на европий. Очевидно, что основной вклад во флуоресценцию на 618 нм происходит при возбуждении на 340 нм.

При титрование БСА-ДТПА-АБТФА ацетатом европия максимум люминесценции наблюдался в точке эквивалентности для каждой концентрации и снижался с увеличением концентрации европия (рис.7). Можно предположить, что максимальная координация иона европия происходила в точке эквивалентности. Это означает, что одна молекула хелата участвует в координации одного иона европия. Увеличение концентрации европия приводило к нарушению этой упорядоченности и появлению дополнительных молекул воды в координационной сфере. Таким образом, молярное соотношение конъюгат /европий составило 1:1.

Предел детекции конъюгата составил 10-11M. Флуоресцирующий комплекс образовывался через 15 минут после смешивания. Для разработки анализа была выбрана область нейтральных рН как наиболее оптимальных для работы со смешанными комплексами европия.

А Б 1,0,0,0,0,0,260 280 300 320 340 360 380 550 600 650 700 Длина волны,нм Длина волны,нм Рис.6. Спектры поглощения (А) и испускания при возбуждении на 340 нм (Б) конъюгата БСА-ДТПА-АБТФА в 0.05M трис-HCl буфере, содержащем 0.15М NaCl, рН 7. Флуоресценция,у.е.

Оптическая плотность,у.е.

Рис.7.

Кривая титрования БСА-ДТПА-АБТФА солью европия в 0.05M 10-6M ABTFA трис-HCl буфере, 10-7M ABTFA содержащем 0.15М NaCl, 10-8M ABTFA рН 7.75 для трех концентраций хелата (10M, 10-7, 10-8 M).

1E-111E-101E-9 1E-8 1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-[EuAc3],M Рис.8.

Калибровочные кривые для 0,определения Т4 в 1,диссоциативном ФИАВР и соответствующий профиль 0,вариации (-), и в 0,недиссоциативном ФИАВР и соответствующий 0,профиль вариации().

0,концентрации T4-БСА -0,мкг/мл, меченные мАт -0,нг/мл.

0,A0–максимум флуоресценции, A – 0,0,2 флуоресценция, у.е.

0,0 0,10 lg [T4], нМ КВ Флуоресценция,у.е.

Флуоресценция, A/A В недиссоциативном ФИАВР иммобилизованный и свободный антигены конкурировали за связывающие центры моноклональных антител. Отличие состояло в том, что на последней стадии, после 1.5 ч инкубации и отмывки, в диссоциативном ФИАВР флуоресценция развивалась только после добавления усиливающего раствора, а в недиссоциативном анализе измерялась сразу после отмывки с поверхности дна лунки. Концентрация 0.33 мкг/мл и 125-250 нг мАт на лунку была найдена оптимальной.

Существует ряд преимуществ в использовании нового хелата. Он не требует добавления усиливающих агентов для развития флуоресценции, в частности, усиливающего раствора, который очень чувствителен к загрязнению лантанидами. Этот хелат обладает низким неспецифическим связыванием и дает возможность использовать меньшее количество антител и стандартов тироксина, т.к. флуоресценция измеряется со дна лунки. Данный анализ занимает около 1,5 часов. Динамический диапазон определяемых концентраций Т4 для анализа с мАт- ИТЦ ДТТА- Eu и для ФИАВР с мАт- ДТПА-АБТФАEu составляет 7-500 нМ. Чувствительность одностадийного недиссоциативного анализа такая же, как у диссоциативного ФИАВР в этой же схеме. При тех же самых условиях оба анализа дают одну и ту же чувствительность – 7нм (рис.8). Отсутствие диссоциации, малые количества антител и анализируемых компонентов, быстрота анализа (одна стадия), и, наконец, чувствительность аналогичная диссоциативному ФИАВР, позволят использовать данный трифункциональный хелат ДТПА-АБТФА-Eu в качестве альтернативы традиционным диссоциативным меткам.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»